匙 峰，梁 帅，王 倩，刘玉梅，杨在君

(西华师范大学 a.组织修复材料工程技术协同创新中心，b.生命科学学院，c.环境科学与工程学院，四川 南充 637009)

骨骼作为组成人体运动系统的一部分，起支撑、保护的作用，且具有代谢、造血等重要生理功能。由于创伤、疾病、骨肿瘤切除等原因引起的骨缺损，是常见的临床疾病，会引起患者骨功能受损、生活质量下降。严重的骨缺损无法自愈，需要植入骨修复材料来填补和修复。据统计，全球每年的骨移植手术大约有220万例[1]。自体骨与同种异体骨由于良好的成骨能力与骨传导性而被认为是治疗骨缺损的第一与第二选择[2]。但是临床中自体骨和异体骨的应用受到许多因素的限制，例如供应的来源有限、免疫原性、二次手术等，从而推动了骨组织工程的发展。

蚕丝是我国的古代文明产物之一，早在4700多年前就已经用于丝织品的制造中。几个世纪前，医生们开始将桑蚕丝用作手术缝合材料。我国在1957年就开始研究以桑蚕丝为原材料的人造血管，并且应用于临床。丝素蛋白是来源于蚕丝的纤维蛋白，作为一种天然高分子材料，避免了化学合成材料的繁琐步骤和副产物的干扰，也没有胶原、动物来源骨等免疫排斥或病原隐患，同时其来源广泛、产量丰富、价格低廉，在骨组织工程研究与应用中具有极大的价值[3]。本文首先介绍丝素蛋白材料结构及其提取纯化方法，随后阐述了丝素蛋白在骨组织工程中应用的材料形式和研究进展，并讨论了丝素蛋白发展的趋势和局限性。

1 丝素蛋白材料

以丝素蛋白作为生物材料应用于骨组织具有以下优势：①生物相容性良好，去除丝胶蛋白后，几乎不会引起机体免疫反应[4]。②生物降解速率可控，可以通过不同的方法调节丝素蛋白降解的速率，使之符合组织再生的需求。其降解产物主要是肽链和游离氨基酸，易于被机体吸收代谢，且对机体无害或无其他不良反应[5]。③机械性能良好，能与一些高性能合成纤维相媲美，并可通过添加其他材料(羟基磷灰石、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素等)进一步提高性能[6-8]。④可加工性能优异，可根据需求与不同材料复合加工成多种形式(薄膜、微球、水凝胶、多孔支架以及复合支架等)，以满足不同需求[9]。⑤热稳定性良好，在250 ℃左右都不会丧失结构完整性，满足医用材料的加工灭菌需求[10]。此外，丝素蛋白还具有止血、高药物渗透性、高氧渗透性、抗酶切性等特性[11-12]。

1.1 丝素蛋白结构

蚕丝主要由两部分组成：内部的丝素蛋白以及外部包裹的丝胶蛋白(图1a)，丝素蛋白约占总量的70%～75%，丝胶蛋白约占总量的20%～25%[4]。除此之外，还有少量蜡质、色素以及无机物等物质[13]。蚕丝作为天然生物丝纤维，其规模化养殖和商业化程度较高，从而使得蛋白原料来源广泛，经济成本低。

丝素蛋白主要含有碳、氢、氧、氮等元素，还含有钾、钙、锶、铁、铜等微量元素[4]。它富含18种氨基酸，其中丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸约占总量的85%。丝素蛋白是纤维状蛋白，由两条肽链构成：重链(H)约396.367 kDa，轻链(L)约25 kDa，二者通过二硫键连接在一起(图1b)[14]。此外，还有被称为P25的糖蛋白，通过疏水作用力与两条肽链组成的复合物结合在一起。丝素蛋白二级结构主要有α-螺旋以及β-折叠，其中，β-折叠主要是由于蛋白序列中(GAGAGS)n和(GAGAGY)n的重复延伸。在聚合状态下，丝素蛋白由结晶区与非结晶区构成，结晶区又分为SilkⅠ与SilkⅡ，SilkⅠ是一种介于α-螺旋与β-折叠的中间结构，呈曲柄形；SilkⅡ为反向平行的β-折叠片层结构，是斜方晶系，其肽链排列整齐，并且由于氢键和分子间引力的存在，使得其抗拉伸的能力强，因而具有很高的强度[15]；此外，非结晶区肽链之间排列不整齐，结合力较弱，使得其抗拉伸的能力弱，因而具有很强的韧性[16-18]。SilkⅠ与SilkⅡ二者比例受到多种因素的控制，比如温度、pH、化学试剂等，而两者比例会影响丝素蛋白的降解速率和力学强度[19-21]。

1.2 丝素蛋白的提取及溶解

由于蚕丝中丝胶蛋白会引起人体的过敏反应，丝素蛋白在应用于组织工程中时，需要先去除具有免疫原性的丝胶蛋白[22]。利用丝素蛋白和丝胶蛋白在水溶液体系中溶解度的差异，可采用酸、碱、皂、酶等处理蚕丝，使丝胶蛋白溶于溶液体系内，经过离心、过滤、透析等方法分离出丝素蛋白。常用的脱胶方法有以下几种：①碳酸钠脱胶；②中性皂脱胶；③酒石酸脱胶；④高温高压水脱胶；⑤碱性蛋白酶脱胶[4,14,23-24]。其中，碳酸钠脱胶最为常见，其将生蚕丝置于质量分数为0.2%的碳酸钠溶液中，在98～100 ℃下脱胶30～45 min，脱胶率可达24.44%。此外，有研究者从丝素蛋白生物来源出发，从蚕生物体中获取丝胶酶，可专一地分解蚕丝中的丝胶蛋白[23]。不同的脱胶方法会对丝素蛋白的力学性能和降解性产生不同的影响[25]。

由于丝素蛋白不能直接溶于水和常规的有机溶剂，使得丝素蛋白在组织工程支架材料加工制备中受到诸多限制。一般来说，溶解脱胶蚕丝纤维主要有两种溶剂体系：六氟异丙醇与离子溶液(离子水/醇溶液)[26]。考虑到六氟异丙醇溶剂的高成本和毒性，通常采用后者。常见的离子水溶液有9.3 g·mol-1溴化锂、质量分数50%氯化钙、9 g·mol-1氰化锂，常见的离子醇溶液包括氯化钙-乙醇-水溶剂(摩尔比1∶2∶8)、溴化锂-乙醇-水溶剂(质量比44∶45∶1)以及四水硝酸钙-醇溶剂(质量比75∶72)等[27]。不同的溶解体系或同一溶解体系的不同物质配比，都会使得脱胶蚕丝的溶解速率不同。在用氯化钙溶解脱胶蚕丝时，溶解速率随氯化钙浓度增大而增大，但当到达一定程度后，则随氯化钙浓度增大而减小[28]。溶剂体系中锂离子被长期大量摄取会产生一定的毒副作用，对神经系统、内分泌系统、肾脏等均有影响[29]。为了纯化丝素蛋白溶液，去除溶剂中的杂离子干扰，一般采用透析袋(截留分子量6000～8000 Da)在纯净水中透析3～5 d得到丝素蛋白水溶液体系[11]。若透析后丝素蛋白浓度过低，则可采用PVA等高浓度溶液反透析或者室温挥发部分溶剂进行浓缩。

为了提高丝素蛋白的溶解性和可加工性，研究者通过化学反应法(如偶联反应、氨基酸接枝、化学接枝)对丝素蛋白进行改性。其中，利用丝素蛋白中的氨基酸氨基，特别是赖氨酸中自由的氨基进行化学接枝被研究得最多。Kim等[30-31]在丝素蛋白自由氨基上接枝具有光敏作用的甲基丙烯酸缩水甘油酯基团，得到的改性丝素蛋白具有良好的水溶性，并且可通过紫外引发形成光交联凝胶，从而应用于3D打印方面。

2 丝素蛋白在骨组织工程领域的应用

骨组织具有疏密有序的孔隙

结构，其再生与自我修复能力有限。从化学成分上看，骨组织由有机部分(胶原、各种蛋白、透明质酸等)与无机部分(羟基磷灰石、碳酸盐、无机盐等)组成，其中有机组分约占骨组织的35%，无机组分约占65%；从组成结构上看，骨组织表面有富含干细胞的骨膜，内部孔隙中分布有骨细胞、破骨细胞和血管组织等。在组织工程领域，利用丝素蛋白良好的生物相容性和降解性，可根据不同目的和加工工艺，将丝素蛋白制备成不同的结构形式，以发挥独特的作用(图2)[4]。在骨组织工程应用中，丝素蛋白主要以微球、水凝胶、膜和多孔支架形式发挥促进骨缺损修复的作用。

2.1 载体微球

骨组织再生过程中涉及多种细胞(包括成骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、干细胞等)的增殖、分化等生理活动，受体内钙磷离子、生长因子等的调控。为了促进骨组织的再生，加速骨缺损的愈合，骨组织工程领域常将外源调控因子(如生长因子、中药提取物、金属离子)引入骨缺损处，靶向刺激细胞生长和组织再生。载药微球可作为上述外源调控因子的载体。载药微球一般为直径1～250 μm的球状实体，由药物吸附或分散在高分子聚合物基质中形成，具有靶向性、缓释与长效性、高药物稳定性、低细胞毒性等优点，已逐渐成为骨组织工程领域的研究热点。

将能提高骨组织再生相关的药物或生长因子分散在丝素蛋白溶液体系内，经特定的加工过程，即可制得具有特定功能的载药微球。常用的制备丝素蛋白微球的方法有乳化分散法、赋形法和凝聚法。刘海龙等[32]制备了丝素蛋白/重组人骨形态发生蛋白-2微球，并通过超声波按照30 mg∶1 g的比例与多孔双相磷酸钙混合，制成了人工骨。在植入绵羊体内的实验中发现，随着材料的降解，首先释放重组人骨形态发生蛋白-2，较小的微球分散在人工骨表面，大的微球则更多的被包裹在内，且其中还含有更小的微球，从而达到缓慢释放的目的，这样就使得重组人骨形态发生蛋白-2始终保持在一定浓度，以促进新骨形成。此外，为加快骨缺损修复过程中患处募集成骨细胞的速率，通常在丝素蛋白中添加海藻酸钠、明胶等材料为细胞的转移提供载体，从而将细胞定向运载至骨缺损处促进骨的再生。纯海藻酸钠载体不利于细胞的黏附与增殖，且降解速率缓慢。在海藻酸钠体系内混入丝素蛋白后，制成丝素蛋白-海藻酸钠混合微球并在其上培养骨髓间充质干细胞，实验发现细胞在复合微球上的黏附能力和增殖能力均有所提高，且能促进成骨细胞内骨钙素的合成[33]。Luetchford等[34]利用丝素蛋白与胶原蛋白的混合材料，通过微流体技术得到尺寸分布均一、孔隙结构丰富的细胞微载体，具有良好的细胞相容性和力学性能。

2.2 水凝胶

水凝胶是由亲水或水溶性的高分子通过物理或化学交联形成的一种三维网络结构，可用于载药和细胞运输。水凝胶的溶液状态含水量较高，可以模仿细胞内部的三维微环境并可以均匀地包裹细胞和药物，同时，部分水凝胶还具有可注射性，利于生物组织的原位再生与重建[35]。水凝胶的这些性质使其被广泛运用于骨组织修复工程领域。与其他高分子相同，可通过对丝素蛋白侧链上的氨基酸活性基团进行化学修饰从而促进丝素蛋白纤维间进行交联的方法制得水凝胶。但丝素蛋白区别于其他高分子的独特优势是利用丝素蛋白分子结构内的β-折叠，使大分子肽链缠绕、聚集，形成蛋白微球胶束，使丝素蛋白凝胶化，避免接枝等过程中有毒化学试剂的使用。常见的有高温、超声、涡流、化学交联以及化学改性等水凝胶化方法[18]。

夏一菁等[36]对丝素蛋白/氧化石墨烯水凝胶进行了研究，发现加入氧化石墨烯后，水凝胶的压缩强度最大能够提升40%，当加入质量分数0.2%的氧化石墨烯时，压缩强度与韧性表现最优；此外，由于丝素蛋白-氧化石墨烯水凝胶中氢键、极性基团的存在，使得材料的降解速率和骨组织的再生速率能更好地匹配，更加适用于骨组织的修复。Li等[37]制备了一种用于软骨组织的丝素蛋白-羧甲基壳聚糖水凝胶，经实验发现其具有良好的机械性能，降解速率与细胞的再生速率相匹配，在其上培养兔软骨细胞，细胞能较好地生长。Zhang等[38]将从软骨细胞提取的细胞外基质与丝素蛋白溶液混合，在PEG的辅助下形成可3D打印的水凝胶支架结构，同时还包裹干细胞，但由于制备的水凝胶力学强度限制，仅能应用于软骨方面。

2.3 膜材料

生物膜结构在体内发挥着重要的作用。骨骼表面的骨膜内富含丰富的干细胞，在骨折愈合过程中起重要作用。骨膜存在骨祖细胞，可增殖分化为成骨细胞。人工制造的丝素蛋白膜材料可模拟骨组织外部的骨膜结构，用于修复骨缺损。丝素蛋白膜的应用十分广泛，不仅可用于骨组织修复，也可用于血管修复、角膜修复以及肌腱修复等领域。丝素蛋白膜的制作方法有溶液-凝胶法、溶液共混法、静电纺法、冷冻干燥法等。Chen等[39]提出一种利用气液界面张力制作丝素蛋白膜的方法：在丝素蛋白溶液中混入不同比例的明胶，然后滴在亚相(水和(NH4)2SO4水溶液)的表面，由于丝素蛋白亲水与疏水片段交替排列的特殊结构，使得丝素蛋白快速自组装，从而在液体表面形成多孔丝素蛋白凝胶薄膜。用这种方法制得的丝素蛋白膜厚度极薄，在其上培养小鼠L929成纤维细胞，细胞在薄膜上能更好地生长。该材料在对生物体内的血管、尿道、骨组织等的修复方面表现出较好的应用前景。后续该课题组在此基础上，进一步与致密的PEG膜、甲壳素膜结合构建了具有抗菌性的三明治结构膜材料[40]。

为提高丝素蛋白膜的机械性能和生物学活性，在膜的制备过程中常混入无机材料、活性因子、金属离子等。张玉[41]将丝素蛋白溶液与氧化石墨烯混合，烘干后得到丝素蛋白/氧化石墨烯复合膜，将其植入兔体内后发现，氧化石墨烯的掺入不仅可以提高复合膜的力学性能(氧化石墨烯含量越高，复合膜内部的β-折叠构象含量越高)，还可促进成骨细胞的生长，诱导骨组织的形成。陆史俊等[42]研究了一种碳酸锶/丝素蛋白纳米纤维膜，将其与骨髓间充质干细胞共培养，发现骨髓间充质干细胞能较好的生长和增殖，这种纳米纤维膜中的碳酸锶可提高膜材料上碱性磷酸酶的活性，使骨髓间充质干细胞的成骨基因表达水平提高，从而使材料具有较好的诱导骨再生的能力。此外，丝素蛋白膜也可以负载促进骨再生相关药物，尤其是一些容易失活的大分子蛋白质物质。

2.4 多孔支架

骨组织内部具有多级微纳米孔隙结构，为骨组织再生过程中细胞的迁移与募集、增殖与分化、血管长入与体液循环提供了空间结构和力学支撑。因此，用于骨修复的多孔支架除了要具备生物材料的一般条件(良好的生物相容性、一定的机械强度等)，还需具有一定的孔隙率和孔隙大小，以容纳细胞的迁移活动。以丝素蛋白为基础，制造多孔支架方法有很多，例如，编制纤维法：先将丝素蛋白纺成纤维，再将纤维进一步编制成支架；颗粒沥滤法：通过添加盐或糖作为成孔剂，制造多孔支架等(图3)[4,43-44]。

为增强纯丝素蛋白力学性能、提高生物活性，在丝素蛋白支架制备中常引入其他物质作为增强相。刘勇等[45]构建了一种丝素蛋白/羟基磷灰石/聚多巴胺/BMP-2多孔支架：先用冷冻干燥法制备丝素蛋白/羟基磷灰石支架，再浸泡入聚多巴胺溶液中，随后接枝骨形态发生蛋白，经实验发现，复合支架的亲水性能、粗糙度相对于丝素蛋白/羟基磷灰石支架而言，均有所增强，细胞在其上的增殖能力也相对更好。Ding等[46]向丝素蛋白/羟基磷灰石支架中负载骨形态发生蛋白-2，通过调节骨形态发生蛋白-2在复合支架中的比例，调节骨形态发生蛋白-2在体内的释放，为细胞在支架上的生长提供了良好的微环境，进一步促进支架的成骨能力。Shao等[47]制备了一种羟基磷灰石/丝素蛋白复合支架，并将其与纯丝素蛋白支架对比，发现二者性能有所不同。在机械性能方面，纯丝素蛋白比较柔韧，伸长率较大，加入了羟基磷灰石后，复合材料的杨氏模量与断裂应力均大于纯丝素蛋白；在细胞增殖方面，前期细胞在纯丝素蛋白支架上生长较好，但后期明显在复合支架上增殖更多，且出现了成熟的纺锤形；在生物矿化方面，复合支架上的碱性磷酸酶活性、骨钙素含量以及矿物沉积物含量均大于纯丝素蛋白支架。由于直接在丝素蛋白溶液体系中混合无机颗粒可能存在混合不均匀的情况，且制备过程中容易发生固液分离，丝素蛋白溶液经冻干后进行再矿化也是一种策略。Shao等[48]采用低浓度丝素蛋白溶液长时间加热，诱导溶液内丝素蛋白自组装为长纤维，并与普通丝素蛋白溶液混合，冻干后较普通丝素蛋白支架力学性能有所增强。进一步将以上冻干支架浸泡在模拟体液中矿化，并采用微波辅助加速矿化过程，短时间内可得到矿化良好的复合多孔支架。

3 总结与展望

丝素蛋白通过与其他各种生物材料相结合，根据需求加工成微球、水凝胶、薄膜、支架等多种形态，发挥着药物靶向、结构支撑、原位诱导等功效，不仅可以应用于骨组织工程，还可应用于软骨、肌腱、韧带、血管、神经等领域。对蚕丝进行深度加工，开发以丝素蛋白为基础的骨组织工程支架，有利于深化蚕丝产业的发展，使低附加值产品向高附加值产品延伸，促进农业和加工业的发展。但仍有些问题亟待解决：首先，由于蚕丝来源、批次差异和提取手段的不同，丝素蛋白原料质量难以保证完全一致，从而造成最终产品质量稳定性问题，限制了其进一步产业化应用研究；其次，以丝素蛋白制备膜、多孔支架等材料的过程一般以实验室小规模研究为基础，在放大生产过程中仍有很多问题亟待解决；再次，丝素蛋白虽已在骨组织工程的体外细胞学研究和动物体内试验阶段取得良好效果，但尚未进入临床研究和验证，对于骨再生过程的细胞外基质矿化、血管形成等过程及机理仍需要更加深入的研究。随着未来加工技术的不断进步与科学研究的不断深入，丝素蛋白材料将在骨组织修复中得到更多的发展应用，为整个组织工程领域开辟更多的发展空间。