宗玲青,钮志林,赵 刚,高胜利,孙桂英

(江苏省苏州市第九人民医院 感染科，江苏 苏州，215000)

肺结核早期无明显症状，多数患者发病时症状易与其他呼吸系统疾病混淆，导致治疗方向有误而错失最佳治疗时机，引起感染恶化，增加治疗难度[1]。因此，早期确诊肺结核有利于临床医生制订有效的治疗方案，从而改善治疗效果。传统痰培养实验筛查肺结核具有较高的准确性，但细菌培养耗时久，效率低，故用于肺结核快速筛查仍有一定局限。T细胞斑点试验(T-SPOT)是一种免疫学技术，其基于结核分枝杆菌(MTB)特异性抗原刺激外周血单个核细胞分泌γ干扰素(INF-γ)的机制，通过检测INF-γ分泌情况判断机体是否存在MTB感染[2]。基因芯片是一种分子药敏技术，与常规细菌培养和药敏试验相比，其可有效缩短检测时间，提高检测效率，还可用于MTB耐药基因检测，快速检测MTB各基因突变情况，判断MTB是否耐药[3]。本研究探讨基因芯片技术联合T-SPOT对肺结核的早期诊断价值和基因芯片技术对MTB耐药基因的检测效能，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取苏州市第九人民医院感染科2017年6月—2019年6月收治的108例高度疑似肺结核患者作为研究对象。纳入标准:① 伴有咳嗽、咳痰、痰中带血、盗汗等症状者;② 咳嗽、咳痰症状持续时间≥2周者;③ 经对症治疗病情仍未好转者;④ 接受基因芯片技术联合T-SPOT诊断者;⑤标本均于无菌环境下保存完好者。排除标准:① 合并肺部恶性肿瘤者;②合并其他病原菌感染者;③ 合并血液系统疾病者;④ 合并急性呼吸衰竭者;⑤ 既往被诊断为结核菌感染(如脊柱结核、结核性胸膜炎等)者;⑥ 有肺部手术史者。108例疑似患者中，男74例，女34例;年龄36～68岁，平均(52.12±2.46)岁;体质量指数(BMI)为18.80～25.40 kg/m2,平均(22.14±0.56) kg/m2;咳嗽、咳痰症状持续时间2.20～4.50周，平均(3.38±0.22)周。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，且患者及家属签署知情同意书(需有相关证明材料)。

1.2 检测方法

1.2.1 T-SPOT方法:于患者入院后采集其空腹外周静脉血5 mL放置于抗凝试管中，置于-20 ℃冷藏箱中保存送检。检测时，采用密度梯度离心法提取血液标本中单个核细胞，对核细胞进行洗涤、提纯，于显微镜下进行细胞计数。将阳性质控品、抗原及培养基等加入A板调控内，确保各板孔中含有25万个核细胞，培养条件为温度37 ℃、时间16～20 h、5%二氧化碳。完成培养后，用缓冲液洗板，各孔中加入50 mL酶标二抗工作液进行孵育(2～8 ℃,孵育1 h),完成后再次冲洗，显色后取蒸馏水冲洗，直至终止显色后于镜下行细胞计数,T-SPOT试剂盒购自鱼跃医疗器械有限公司。若阴性孔细胞计数≥6，检测孔细胞计数≥2倍的阴性孔细胞计数，即视为阳性，反之则视为阴性。

1.2.2 痰培养方法:将痰标本接种于酸性改良罗氏培养基(北京宾宇科创生物科技发展有限公司)斜面上，每份痰标本接种2管，放置于37 ℃环境中培养。若发现菌落生长，经涂片抗酸染色后呈阳性可报告为MTB生长，若未见菌落生长则报告培养结果为阴性。

1.2.3 基因芯片技术检测方法:所有试剂、染色液、培养液、显色液等购自珠海贝索生物科技有限公司;MTB耐药基因检测芯片(北京博奥生物有限公司);核酸快速提取仪(杭州奥盛仪器有限公司，型号Auto-Pure48);荧光定量仪[艾康生物技术(杭州)有限公司，型号RTQ-960];微阵列芯片扫描仪[美谷分子仪器(上海)有限公司，型号GenePix 4100A]。① 标本制作及核酸提取。将痰标本与等量10%氢氧化钠溶液混合，震荡液化15 min,以3 035 ×g离心5 min弃上清，加入1 mL生理盐水，再次震荡后以12 830 ×g离心5 min后弃上清。将80 μg核酸提取液加入试管中并加入上述标本，采用核酸快速提取仪震荡5 min,95 ℃水浴5 min后再以8 910×g离心1 min。② 聚合酶链反应(PCR)扩增。采用不对称法扩增相关基因位点，分别取PCR扩增试剂1、2、3对3管样品进行PCR扩增反应，向3管中分别加入2 μg模板DNA和18 μg扩增试剂。每管PCR反应体系总体积为20 μg,置于PCR仪中扩增。反应条件为37 ℃激活10 min;94 ℃变性600 s;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，循环35次;94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，循环10次;72 ℃ 420 s。③ 芯片杂交与结果判读。扩增反应完成后，分别在利福平、异烟肼芯片杂交管中加入3 μg扩增物,1、2、9 μg缓冲液,15 μg杂交反应混合物95 ℃变性5 min,立即冰水浴3 min。吹吸混匀后，从小孔处向芯片点阵内加入14.5 μg杂交混合物，持续杂交2 h,按设置的洗涤程序洗片、甩干，最后采用微阵列芯片扫描仪进行信号读取和结果判读，由系统软件给出结果。

1.2.4 DNA测序:采用接种环收集生长的细菌置于去离子水中，混匀后95 ℃灭活20 min,离心后获取菌株DNA,将提取的菌株DNA送至珠海贝索生物科技有限公司检测。

1.3 治疗方法

所有确诊患者采用2HRZE/4HR方案治疗:强化期采用2HRZE方案，治疗2个月，口服利福平胶囊(R,河北恒利集团制药股份有限公司，国药准字H13022566,规格0.15 g/粒),0.45 g/次,1次/d;口服异烟肼片(H,武汉第六制药有限公司，国药准字H42022028,规格100 mg/片),300 mg/次,1次/d;口服吡嗪酰胺片(Z,成都锦华药业有限责任公司，国药准字H51020876,规格0.25 g/片),0.50 g/次,3次/d;口服乙胺丁醇片(E,西南药业股份有限公司，国药准字H50020137,规格0.25 g/片),0.75 g/次,1次/d。巩固期采用4HR方案，口服H、R,1次/d,共治疗4个月。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 痰MTB培养检测结果

本研究共纳入108例高度疑似肺结核患者，经痰培养确诊肺结核100例，占92.59%(100/108)。

2.2 基因芯片技术、T-SPOT单独及联合应用的诊断效能

以痰MTB培养检测结果为“金标准”,T-SPOT诊断肺结核的灵敏度、特异度和准确度为88.00%(88/100)、50.00%(4/8)和85.19%(92/108),基因芯片技术诊断肺结核的灵敏度、特异度和准确度为90.00%(90/100)、50.00%(4/8)和87.04%(94/108),基因芯片技术联合T-SPOT诊断肺结核的灵敏度、特异度和准确度为98.00%(98/100)、75.00%(6/8)和96.30%(104/108)。基因芯片技术联合T-SPOT诊断肺结核的灵敏度、准确度均高于基因芯片技术、T-SPOT单一诊断，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1～4。

表1 T-SPOT的诊断结果 例

表2 基因芯片技术的诊断结果 例

表4 基因芯片技术、T-SPOT单独及联合应用的诊断效能比较 %

2.3 基因芯片技术对MTB耐药基因的检测结果

以DNA测序检测结果为“金标准”，基因芯片检测MTB耐药基因的灵敏度为92.31%(24/26),特异度为97.37%(74/76),准确度为96.08%(98/102),见表5。

表5 基因芯片技术对MTB耐药基因的检测结果

3 讨 论

肺结核潜伏期较长，潜伏期或非活动期肺结核患者无典型症状，且不具备传播性[4]。相关研究[5]显示，感染MTB后，患者病情若持续进展可出现感染恶化，不仅会加速MTB传播，还会导致感染扩散至其他器官，增加多器官衰竭风险，进而升高病死率。由此可见，加强MTB筛查对于减少肺结核传播和改善肺结核患者病情具有重要意义。

研究[6]指出，患者感染MTB后,MTB可在人体内长期潜藏并侵袭免疫系统，引发不同程度免疫功能损伤，从而产生持续的免疫反应。T-SPOT通过检测外周血中INF-γ分泌量来判断抗原特异性T淋巴细胞的免疫反应，可反映免疫系统是否被MTB侵袭，进而判断机体是否存在MTB感染[7]。基因芯片技术是基于多重PCR结合的基因检测技术，将样本DNA或RNA与探针杂交，采用特定仪器和系统进行扫描、显色，量化后对杂交结果进行分析，进而得出检测结果[8]。

本研究结果显示,T-SPOT联合基因芯片技术诊断肺结核具有较高的灵敏度和准确度。人体T细胞遭受MTB抗原刺激后，活化的效应T细胞可产生MTB感染免疫中关键性细胞因子INF-γ;T-SPOT通过检测T细胞介导的INF-γ反应，评估机体对MTB产生的体液免疫及细胞免疫情况，进而判断机体是否存在MTB感染[9-10]。T-SPOT可在MTB感染早期患者体内检出效应T细胞，且通常24 h内可得到检测结果，将其用于肺结核早期诊断中具有较高灵敏度，尤其适用于肺结核合并免疫缺陷患者[11-12]。基因芯片可固定多针探针于基片上，并将探针与样本的DNA 或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样本分子的数量和序列信息[13-14];基因芯片可将大量探针固定于支持物上，一次可检测大量样本，有利于提高诊断效能，缩短诊断时间[15]。因此，基因芯片技术联合T-SPOT诊断肺结核具有较高的灵敏度和准确度。

此外，基因芯片技术可反映基因突变位点及类型，还可同时测定多个基因产生的突变，相较于其他类型检测技术，其具有较高的灵敏度[16]。基因芯片技术检测时可固定所有突变探针于1张芯片上，仅需1次杂交，即可获取对各种抗结核药物的耐药性及敏感性结果[17]。王丹吉等[18]研究显示，基因芯片技术用于检测利福平、异烟肼耐药基因具有较高的灵敏度和特异度，可弥补传统药物敏感试验的不足。本研究结果显示，基因芯片技术检测MTB耐药基因具有较高的灵敏度、特异度 准确度，进一步证实基因芯片技术在肺结核耐药基因检测中具有较高的应用价值。

综上所述，基因芯片技术联合T-SPOT诊断肺结核的灵敏度、准确度较高，且基因芯片技术对MTB耐药基因具有较高的检测效能，可为临床合理选用抗结核药物提供有力依据。