李治君,吴 松,李 成 ,马 恩

(1.三二〇一医院 检验科,陕西 汉中,723000;陕西省宝鸡市中心医院,2.检验科,3.血管外科,陕西 宝鸡,721008)

目前，血管内介入治疗已成为动脉闭塞性疾病的主要治疗方法之一[1]。尽管该治疗成功率较高，但仍有部分患者会受到支架内再狭窄(ISR)的困扰，这是由血管内皮损伤和内膜增生后血栓形成使得血管通畅性降低所致[2]。管腔狭窄和内膜增生均与血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖相关[3]，因此基于VSMCs迁移和增殖的分子生物学和遗传学机制寻找有效的生物标志物对于ISR的预测和诊断是非常重要的。ISR可能还伴随着特定微小RNA(miRNAs)的异常表达，例如微小RNA-128-3p(miR-128-3p)已被证实是炎症和血管生成的重要调节因子，对VSMCs迁移和增殖具有显著抑制作用[4]。但miR-128-3p与血管介入术后ISR的关系目前尚未完全阐明。本研究通过检测血清miR-128-3p表达进一步了解其在ISR预测中的临床价值，旨在为个体化干预下肢动脉硬化闭塞症(LEAOD)提供更好的方案。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年3月—2021年10月曾在三二〇一医院血管外科接受血管介入治疗的406例LEAOD患者作为研究对象，男307例、女99例，年龄33～79岁，病程0.8～7.3年,Fontaine分期为Ⅱ期174例、Ⅲ期207例、Ⅳ期25例。纳入标准:接受CT血管造影(CTA)检查后确诊LEAOD者;动脉脉搏减弱或消失，营养失调，下肢发凉、无力、苍白者。排除标准:① 置入支架后拒绝接受CTA检查者;② 未服用抗血小板聚集药物者;③ ≥2个部位存在ISR,并在确诊后1个月内接受血运重建治疗者;④ 左室射血分数≤40%的严重左室功能障碍者;⑤ 重要器官功能不全和严重疾病患者，如肝功能障碍(各种致病因素对肝实质细胞和枯否细胞造成严重损害)、肾功能障碍(严重肾小球损害、体内代谢废物排泄紊乱、水电解质和酸碱平衡紊乱)、肺功能障碍(呼吸衰竭)、脑功能障碍(脑损伤和脑震荡)、感染(细菌、病毒和寄生虫感染)、中毒(有机磷或有毒气体中毒)、心血管和脑血管疾病(脑内出血、脑血栓和颅内压升高)、脑老化以及其他功能障碍等;⑥合并结缔组织疾病、自身免疫性疾病、急性心肌梗死或恶性肿瘤者。本研究经三二〇一医院伦理委员会审核批准，确认所有研究内容均按照相关规定和指导方针进行，且纳入患者均签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

介入治疗开始前和治疗后72 h内，采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管采集患者外周血3～5 mL,以2 000转/min速度离心5 min,13 000转/min离心10 min,收集上清液存放在-80 ℃环境中备用。miR-128-3p引物序列:(正向)5′-GGTCAGTGAACCGGTC-3′,(反向)5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6mRNA引物序列:(正向)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,(反向)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用mirVana miRNA分离试剂盒(美国Thermo Fisher公司)从血液中提取总miRNAs,用5 μL miRNA在20 μL反应体系中进行逆转录。反应条件:16 ℃水浴30 min,42 ℃水浴30 min,85 ℃水浴5 min,70 ℃加热10 min。应用Prism 7000荧光定量PCR系统(美国Thermo Fisher公司)检测血清miR-128-3p相对表达量，反应体系20 μL,包含5 μmol/L上游引物、下游引物各0.5 μL和2 μL cDNA模板,4种dNTP共2 μL,Tag DNA聚合酶0.25 μL,10×扩增缓冲液2 μL,Mg2+(1.5 mmol/L) 1.5 μL,加ddH2O补充至20 μL。反应条件:95 ℃水浴3 min,随后95 ℃水浴12 s加62 ℃水浴50 s,共循环40次。将U6用作内参基因。

1.3 酶联免疫吸附测定

采用人用酶联免疫吸附测定试剂盒(美国IBL公司)检测血清白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)水平。

1.4 介入治疗

根据术前CTA成像结果选择合适的介入治疗方案。如果狭窄或闭塞发生在股浅动脉中段或远端第3段或腘动脉，则首选同侧股动脉。如果狭窄或闭塞发生在股浅动脉近端第3段或髂动脉，患者需行腔内治疗(包括导管直接溶栓、药物机械性溶栓、经皮抽吸、保护性植入Greenfield滤器、球囊扩张联合支架植入)。采用“翻山鞘”股外侧动脉逆行穿刺方式进行腔内治疗。穿刺结束后，局部麻醉患者，植入鞘管，行靶动脉造影，选择治疗方案。狭窄血管长度<3 cm的患者选用经皮血管腔内血管成形术(PTA)，PTA术后残余狭窄≥30%者选用血管内支架，狭窄血管长度>10 cm或完全闭塞的患者选用动脉旋磨术。在此条件下，根据不同的手术方案，选用不同类型的导丝。PTA微球囊扩张选用ev3 NanoCross和Bantam纤维支架，支架植入选用自膨胀金属支架(ev3 ProtegeEverFlex或BARD LifeStent XL)。介入治疗成功被定义为使病变血管管腔直径狭窄程度<30%,没有明显的动脉夹层或严重的并发症，否则视为介入治疗失败。

1.5 随访及ISR判断标准

随访期间对患者进行住院访视和电话随访，观察患者跛行症状和动脉狭窄情况。术后6个月，对患者进行CTA分析，检测踝臂指数(ABI)。根据治疗结果，将本研究纳入患者分为再狭窄组和非再狭窄组。治疗有效的评估标准:出院前复查CTA，符合血管内介入治疗成功的判断标准，且ABI增加，下肢间歇性跛行、休息痛等症状持续缓解，糜烂完全痊愈。ISR的判断标准:符合治疗有效标准，但最后一次随访的ABI低于治疗前，CTA复查显示支架内及支架两端5 mm内血管腔狭窄率≥50%。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 2组患者基线特征比较

再狭窄组患者的平均年龄高于非再狭窄组，合并糖尿病、高血压病者占比高于非再狭窄组,Fontaine分期为Ⅲ期、Ⅳ期者占比高于非再狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05);2组患者在年龄、性别、体质量指数、病程、吸烟史、冠心病、高脂血症、术前用药史、术后规律用药和术后规律运动方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 再狭窄组和非再狭窄组患者基线特征比较

2.2 2组患者血清miR-128-3p水平比较

术后，再狭窄组、非再狭窄组血清miR-128-3p水平均低于术前，差异有统计学意义(P<0.05);手术前后，再狭窄组血清miR-128-3p水平均高于非再狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者血清微小RNA-128-3p水平比较

2.3 术前血清miR-128-3p水平对ISR的预测价值

ROC曲线显示，术前血清miR-128-3p水平预测ISR的曲线下面积为0.712(95%CI为0.644～0.781),约登指数为0.335,敏感度、特异度分别为40.5%、93.0%,见图1。

2.4 术前血清miR-128-3p水平与LEAOD患者临床病理特征的关系

再狭窄组中，有糖尿病史、有高血压病史、年龄≥50岁患者的血清miR-128-3p水平分别高于无糖尿病史、无高血压病史、年龄<50岁患者，差异有统计学意义(P<0.05),表明再狭窄组术前血清miR-128-3p水平与年龄、糖尿病史和高血压病史显著相关(P<0.05);再狭窄组术前血清miR-128-3p水平与性别、Fontaine分期、吸烟史、冠心病史和高脂血症病史均无显著相关性(P>0.05)。非再狭窄组术前血清miR-128-3p水平与年龄、性别、Fontaine分期、吸烟史及糖尿病、高血压病、冠心病、高脂血症病史均无显著相关性(P>0.05)。见表3。

表3 术前血清微小RNA-128-3p水平与2组LEAOD患者临床病理特征的关系

2.5 血管介入治疗后ISR危险因素的二元Logistic回归模型分析

二元Logistic回归模型分析结果显示，年龄≥50岁、Fontaine分期Ⅲ～Ⅳ期、有高血压病史、有糖尿病史和术前血清miR-128-3p表达升高均为血管介入治疗后ISR的独立危险因素(P<0.05),见表4。

表4 血管介入治疗后再狭窄危险因素的二元Logistic回归模型分析

2.6 2组患者术前血清细胞因子水平比较

再狭窄组术前血清IL-6、IL-8、TNF-α水平高于非再狭窄组，术前血清TIMP-1水平低于非再狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 2组患者术前血清细胞因子水平分析[M(P25,P75)]

2.7 再狭窄组患者术前血清miR-128-3p表达与细胞因子水平的相关性

Pearson相关性分析结果显示，术前血清miR-128-3p表达水平与血清IL-6、IL-8水平呈显著正相关(rs=0.646、0.621,P<0.001),与TIMP-1水平呈显著负相关(rs=-0.759,P<0.001);术前血清miR-128-3p表达水平与IL-10、IL-1β、TNF-α水平无显著相关性(rs=-0.069、0.194、0.130,P>0.05)。

3 讨 论

相关研究[5]表明，外周血管疾病患者介入治疗后发生ISR的概率相对较高。学者[6-7]认为，这与血管重塑、内膜异常生长、阻碍炎症反应的聚合物吸收、术后血管弹性回缩等因素有关。因此，探索ISR的发生机制和预测因子具有重要的临床意义。本研究发现,miR-128-3p是ISR的一个强有力的独立预测因子。

miRNAs是一类小的非编码RNA,与特异性mRNAs的3′端非翻译区(3′UTR)结合，可抑制靶基因mRNA的表达[8]。目前，在人类基因组中，上百种miRNAs已被证实在血管内皮细胞(VSMC)的增殖和迁移中起着关键作用[9-10]。VSMCs的异常增殖是导致外周血管疾病的主要原因，如动脉粥样硬化、动脉再狭窄和动脉瘤[11]。目前治疗阻塞性增生性血管病变的方法包括使用药物洗脱支架，这种装置可物理性地扩张血管腔，并释放抗增殖药物抑制继发性VSMCs激活和迁移进入血管腔。然而，抗增殖药物缺乏特异性，其对所有类型的细胞均有同样的作用。动脉再狭窄的细胞特异性治疗则利用了miRNAs的作用，其中miR-143和miR-145家族成员具有血管平滑肌表达特异性，在VSMCs表型开关的调控中起着关键作用[12]。但这2种miRNAs在体内其他组织中的表达水平非常高，一方面可能很难使其表达水平进一步上调至治疗水平，另一方面可能会影响其对ISR风险的预测作用。miR-128-3p与miR-143、miR-145家族成员一样，亦参与血管平滑肌增殖、血管生成等过程[13]。QU C等[14]证实,miR-128-3p通过抑制人叉头框蛋白O4和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达而抑制VSMCs的体外增殖和迁移，并可进一步抑制小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的表达。miR-128-3p是VSMCs的重要调节剂[4],VISTBAKKA J等[15]发现，多发性硬化症患者循环miR-128-3p水平普遍升高，且其与运动障碍和疾病活动度存在密切联系。本研究结果显示，血清miR-128-3p水平升高可能与ISR发生风险相关。

既往研究的关注点主要集中在miRNAs的筛选方面，但很少关注其相应的下游靶基因水平或相关因素，而这通常不足以支持其潜在的生物标志物作用[16]。本研究发现，与非再狭窄组患者相比，再狭窄组患者的血清IL-6、IL-8、TNF-α表达水平显著更高,TIMP-1表达水平显著更低，且术前血清miR-128-3p表达水平与血清IL-6、IL-8水平呈显著正相关，与TIMP-1水平呈显著负相关。由此表明，再狭窄患者中miR-128-3p/TIMP-1/IL-6循环级联反应的改变，与炎症反应信号通路密切相关。进一步推测,miR-128-3p及其下游因子的变化可能参与了ISR的进展过程。众所周知,ISR与基质金属蛋白酶(MMPs)的激活及其内源性抑制剂(TIMPs)的下调有关，导致动脉壁基质降解和弹性降低，引起内皮炎症和血管通透性增加[17]。荣钰等[18]发现，血清MMP-9、TIMP-1水平对冠状动脉ISR具有良好的诊断价值。而miR-128-3p在ISR发生期间表达增高，导致靶基因表达降低，从而限制了对MMPs活性的抑制作用。因为TIMPs对于抑制炎症反应是必不可少的，所以TIMP-1在ISR发生过程中应该处于低水平状态。从分子生物学角度而言,TIMP-1与IL-6、IL-8存在负相关[19-20]，IL-6、IL-8表达升高，会导致斑块不稳定性增加[21]。在支架植入后的血管壁修复过程中,IL-6和IL-8的变化是非线性的，其仅在炎症反应阶段才起到重要作用，故IL-6、IL-8对ISR的预测效能有限。VSMCs的增殖和迁移是导致新生内膜增生的关键细胞事件，本研究从另一角度验证了ISR的炎症级联反应，炎症相关因子通常在循环中分布更为广泛，本研究基于既往基础研究结论定量检测了ISR级联反应的关键标志物，结果与既往研究高度一致。

综上所述，血清miR-128-3p水平或可成为LEAOD患者血管介入治疗后ISR的特异性生物标志物。然而，本研究为单中心研究且样本量较少，未来还需开展多中心大样本量研究进一步验证miR-128-3p及其下游靶基因作为ISR实用生物标志物的临床效能。