桂红芽，王姝妹，张晓燕，章孝成，黄升海，何茂章

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染所诱发的下呼吸道疾病是导致婴幼儿死亡的重要因素之一，目前RSV致病机制尚未阐明，且无商品化疫苗[1-2]。研究[3]表明肠道微生物平衡对肺部健康至关重要，肠道与肺之间的相互联系，现称之为“肠-肺轴”。肠道微生物种类和代谢产物的改变与免疫反应、炎症以及肺部疾病的发展有关[4]。肠道菌群代谢产物可影响肺部稳态，如短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)被证明可通过增加调节性T细胞促进白介素-10产生，抑制组蛋白脱乙酰化和一型干扰素从而缓解上、下呼吸道炎症[5]。除此之外，菌群产生的其他代谢物产物如组胺、12,13-diHOME可通过影响免疫细胞数量及细胞因子水平促进肺部炎症。研究[6]表明，RSV感染后血清胆汁酸谱发生改变。孟欣 等[7]通过GC-MS代谢组学分析发现尿液和粪便中乳酸和氨基酸类代谢物在Case组与Ctrl组间差异显著。不同肠道部位菌群数量和种类具有明显差异，关于RSV感染后盲肠代谢物组成研究尚少。因此研究RSV感染后盲肠代谢物的变化可为后期靶向调控或治疗肺部炎症性疾病提供靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂 DMEM细胞培养基(美国 Gibco 公司)；水合氯醛(上海MACKLIN公司)；色谱级甲醇、乙腈(美国Thermo公司)；2-氯苯丙氨酸(上海Aladdin公司)；甲酸(美国Merck公司)；甲酸铵(美国Sigma公司)。

1.1.2主要仪器 UltiMate 3000高效液相色谱仪、Q Exactive Focus质谱仪(美国Thermo公司)，H1650-W冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，QL-866混匀仪(郑州南北仪器有限公司)，KW-100TDV超声波清洗器(昆山舒美公司)，SCIENTZ-48组织研磨器(宁波新芝公司)。

1.1.3病毒和动物模型构建 RSV-Long株由笔者单位保存。SPF级6～7周龄Balb/c鼠(雌性)购自安徽医科大学实验动物中心并饲养在安徽医科大学基础医学院P2动物房。实验(Case)组小鼠经10%水合氯醛(200 μl/只)腹腔注射麻醉后经鼻滴入50 μl无菌RSV-Long株病毒悬液(n=7)，对照(Ctrl)组小鼠采用同体积的无菌DMEM液滴鼻(n=6)。感染3 d后，腹腔注射水合氯醛深度麻醉Balb/c小鼠。行75%乙醇溶液擦拭腹部，在超净工作台对小鼠进行解剖，取下盲肠组织(含内容物)装入无菌冻存管后放入液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1盲肠内容物代谢物提取 快速称取100 mg盲肠内容物(±1%)于2 ml EP 管中(置于冰上)，加入提前预冷的 0.6 ml 2-氯苯丙氨酸(0.004 g/L)甲醇(-20 ℃)，涡旋振荡30 s；此外，向之前的管子中加入 100 mg 玻璃珠，在高通量组织研磨仪中以60 Hz 频率研磨 90 s；随即进行室温超声 10 min；样品以12 000 r/min离心10 min(4 ℃)。用0.22 μm膜对300 μl上清液进行过滤并加入到色谱进样瓶中；QC(quality control，用来校正样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误)样品为每个样本各取10 μl 混合而成；剩余待测样本将根据每6个样本穿插一个QC样本的顺序进行液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)检测，进样体积为3 μl。

1.2.2液相色谱质谱联用分析

1.2.2.1色谱条件 超高效液相色谱分析采用 Thermo Ultimate 3000系统，色谱柱为 ACQUITY UPLC® HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm)，自动进样器和色谱柱温度分别维持在 4 ℃和40 ℃，流速为0.25 ml/min，进样体积设定为2 μl并进行梯度洗脱，正离子流动相为0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D)；负离子流动相为5 mmol/L甲酸铵水(A)-乙腈(B)。样品的梯度洗脱程序设定为：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2% D-正模式(14～17 min，2% B-负模式)。

1.2.2.2质谱条件 质谱采集系统使用Thermo Q Exactive Focus，配备电喷雾离子源(ESI)，具有正负离子扫描模式。电喷雾源参数设定如下：毛细管电压正、负离子条件下分别设定为3.50 kV和2.50 kV；样本和萃取锥孔电压分别为40 V和4.0 V。脱溶剂气流量为800 L/h，温度为400 ℃，锥孔气流量为40 L/h，温度为100 ℃。分辨率为70 000 进行数据全扫描，数据采集范围为0.08～1 ku，并采用 HCD 进行二级裂解，碰撞电压为 30 eV，同时采用动态排除去除不必要的质谱二级碎片信息。

1.2.2.3质谱采集数据处理 采用Proteowizard软件(v3.0.8789)将质谱下机原始数据格式raw转换为mzXML格式(此为XCMS软件的输入文件格式)；基于R软件(v3.3.2)的XCMS程序包进行如下数据处理：峰识别(peaks identification)、峰过滤(peaks filtration)、峰对齐(peaks alignment);主要参数设定如下：bw=2, ppm=15, peakwidth=c(5, 30), mzwid=0.015, mzdiff=0.01, method=centWave；得到包括质荷比(mass to charge ratio, m/z)、保留时间(retention time, rt)、峰面积(intensity)等信息的三维数据矩阵用于后续生物信息学统计分析。

1.3 统计学处理首先对离子强度数据表进行基于峰面积的批次归一化处理(batch normalization)。采用SIMCA-P软件(14.1版本，Umetrics公司)对经过归一化的数据进行多元统计分析：如主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)数据分析。单变量统计分析采用R软件Wilcoxon Mann-Whitney组间差异检验。初步筛选符合P<0.05、 OPLS-DA第一主成分变量重要性投影(variable important in the projection，VIP)>1，两个条件的代谢物用于进一步构建二元逻辑回归模型，筛选能够预测RSV感染的代谢物标志物，通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)并计算曲线线下面积(area under the curve，AUC)来表征模型预测的准确性。利用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)网站对鉴定出的差异代谢物进行代谢通路分析。

2 结果

2.1 小鼠盲肠内容物代谢轮廓基于UPLC-QTOF-MS平台所采集的正、负离子模式基峰色谱(BPC)图(图1)，Case组小鼠盲肠内容物图谱与Ctrl组小鼠有明显差别。

图1 Case组模型小鼠和Ctrl组小鼠盲肠内容物代谢组学色谱基峰图A:正离子模式；B:负离子模式

QC样本质谱峰变异系数统计见图2，可以看到离子特征峰相对标准偏差(RSD)<30%的比例能达到80%左右，而且PCA图显示QC样本分布集中，说明数据稳定性和可重复性良好。

图2 基于代谢物特征峰的主成分分析图和QC样本特征峰RSD分布图A:正离子模式；B:负离子模式

2.2 差异代谢物筛选与鉴定正、负离子模式分别得到33 200、28 405个前体分子。利用OPLS-DA对Case组和Ctrl组盲肠内容物代谢组学特征值进行差异分析，见图3。正离子和负离子模式下Case组和Ctrl组均显示明显的分离。

图3 正离子(A)和负离子(B)模式下两组代谢谱OPLS-DA得分图

RSV小鼠模型建立后盲肠内容物差异代谢物以组间P<0.05、VIP>1为过滤标准，分别在正离子模式和负离子模式下筛选到3 310和2 714个组间差异代谢物特征值。合并正负离子后进行代谢物的定性分析，代谢物的鉴定首先需获得精确的代谢物分子量(分子量误差<15 ppm)，再根据代谢物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB数据库(http://www.hmdb.ca)、 Metlin数据库(http://metlin.scripps.edu)和massbank(http://www.massbank.jp/)等商业数据库及自建标准品数据库中进一步匹配注释获得代谢物准确信息。根据注释结果得到33个有确定名称的组间差异代谢物生物标志物并通过热图进行展示，见图4。

图4 经注释后在模型组和对照组间差异显著的代谢物热图

2.3 随机森林筛选预测RSV感染的代谢物标志物为进一步解析盲肠内容物代谢物变化与RSV感染的关系，对33个组间差异代谢物进一步构建随机森林分类模型，筛选能用于准确预测RSV感染的代谢物标志物。随机森林分类模型鉴定到16个对模型分32类最重要的代谢物，按照“MeanDecreaseAccuracy”参数排序后主要有：鹅去氧胆酸甘氨酸耦合物、还原核黄素、dAMP等。ROC曲线分析结果显示16个代谢物能以高稳定性和高准确率将Case组和Ctrl组区分开来，其中ROC曲线线下面积AUC值为100%，灵敏度为100%，特异性为100%。见图5。

图5 随机森林分类模型筛选与RSV感染相关代谢物标志物A：采用随机森林法对代谢物进行平均精确度下降系数排序；B：利用随机森林模型预测Case组和Ctrl组的受试者操作特征曲线

2.4 代谢通路分析将随机森林分析鉴定到的16个代谢物上传到Metaboanalyst网站进行通路分析。KEGG数据库以编码代谢物的基因和基因组的功能信息为基础，以代谢反应为线索，将可能的代谢途径及对应的调控蛋白进行串联，以图形化的方式展示细胞生理生化过程。代谢物的富集分析结果显示(图6)，Case组和Ctrl组盲肠内容物的差异代谢物主要富集到赖氨酸分解、半胱氨酸和蛋氨酸代谢和丙酸盐代谢通路。

图6 差异代谢物代谢组通路气泡图

3 讨论

机体微生物组对宿主免疫至关重要，RSV感染刺激机体抗病毒免疫会导致肠道菌群紊乱。呼吸道病毒与肠道菌群关系密切，病毒感染诱导肠道菌群失调后，改变了固有细菌代谢能力，此种情况下肠腔内代谢产物的数量和种类与正常稳态情况下差异巨大。盲肠菌群是发酵宿主难消化膳食纤维的主要场所，产生大量的短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸，短链脂肪酸可发挥局部和系统影响。研究[8]表明短链脂肪酸可以通过激活G-蛋白偶联受体发挥调控免疫细胞的激活和功能，此外还可以抑制组蛋白去乙酰化酶活性，维持肠道稳态。已有研究[9]显示孕妇摄入足量的水果和蔬菜(膳食纤维来源用于产生短链脂肪酸)可保护后代抵御RSV感染。有研究[10]证明给小鼠补充高膳食纤维饮食可通过降低病毒载量和炎症抵御RSV疾病，该保护方式依赖于肠道菌群及其产生的短链脂肪酸，其中小鼠和细胞实验表明，乙酸可诱导肺部的β干扰素(interferon , IFN-β)生成、促进Ⅰ型IFN应答，IFN-Ⅰ受体介导了乙酸对RSV感染的抵抗作用，该作用还依赖于G蛋白偶联受体Gpr43和核因子κB(NF-κB)的活化。

本研究中PCA和OPLS-DA均显示Case组和Ctrl组小鼠的盲肠内容物样本能够完全分离，说明两组盲肠内容物代谢谱有明显差异，提示小鼠感染RSV后盲肠内容物代谢发生紊乱。结果显示，Case组小鼠盲肠显著富集L-丝氨酸、油酸等代谢物和脂质分子。Yan et al[11]采用人冠状病毒229E(HCoV-229E)为模型冠状病毒研究冠状病毒感染后宿主细胞脂质的变化，发现24种脂类包括油酸、亚油酸和花生四烯酸等在细胞感染后显著上调。病毒复制需要特定的细胞脂质成分，任何脂质组分的破坏都可能降低病毒复制的效率。甘氨酸鹅去氧胆酸在Case组显著富集，而且随机森林模型鉴定出甘氨酸鹅去氧胆酸是预测RSV感染最重要的代谢物标志物(图5A)，甘氨酸鹅去氧胆酸去耦合作用需要肠道菌群的参与以及RSV感染后甘氨酸鹅去氧胆酸的升高说明胆汁酸的正常“肝肠循环”发生失调[12]。上述结果初步说明RSV感染会影响盲肠胆汁酸代谢发生改变。研究表明甲硫氨酸是抗氧化物质谷胱甘肽和牛磺酸的前体物质[13], 谷胱甘肽可以通过清除羟自由基及超氧化物来保护机体[14], 所以盲肠中甲硫氨酸含量的降低可能是RSV病毒通过“肺-肠轴”诱发肠道损伤及菌群代谢的潜在原因之一。本研究显示，随机森林分析筛选出16种可将RSV和正常鼠区分的差异代谢物，说明它们可能是潜在的代谢物标志物。代谢物标志物的筛选可为RSV的诊断和开发靶向RSV感染的小分子药物研究提供线索。