郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer, PC)是男性最常见的恶性疾病，发病率为3/10 000。由于世界老年化人口不断增加，预计到2030年，PC患者将超过170万，新增死亡人数约为49.9万[1]。目前，分子靶向治疗已成为肿瘤研究的热点。然后，针对已知的PC基因靶点的治疗没有获得满意的效果[2]。因此，寻找更有效的分子靶点是当前研究PC靶向治疗的重要任务之一。microRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA分子，参与调节多种生物学过程，如细胞周期、细胞凋亡、器官发育、组织再生、衰老，也参与PC的发病机制。已有研究[3]证实miR-143在PC组织的表达水平低于癌旁组织，表明miR-143与PC存在联系。但对于miR-143在PC发生发展中的分子机制，目前还不清楚。该研究中分析了PC细胞株PC3中miR-143的表达水平，并通过慢病毒建立稳定转染miR-143的PC3细胞，分析miR-143对PC3细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。利用生物信息学分析miR-143的潜在靶基因，并使用荧光素酶报告基因系统进行验证。以期为寻找更有效的PC治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人PC3细胞购自武汉中国典型培养物保藏中心；胎牛血清、RPMI-1640培养基、青链霉素液、胰蛋白酶-EDTA消化液和Lipofectamine 3000均购自美国Thermo Fisher公司；细胞培养箱、TRIzol reagent购自美国赛默飞公司；miScript II RT Kit试剂盒购自德国Qiagen公司；Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit购自上海吉玛基因公司；聚凝胺、嘌呤霉素、CCK-8检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒购自上海Beyotime Biotechnology公司；双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司；携带has-miR-143及其对照(miR-NC)的慢病毒购自上海汉恒生物科技有限公司；包含TFF3 3′-UTR的野生型(WT-pGL3-TFF3)、突变型(Mut-pGL3-TFF3)荧光素酶报告基因质粒和真核表达质粒(pCNDA3.1-TFF3)购自滁州通用生物技术有限公司；miR-143 mimic及对照购自上海吉玛制药技术有限公司。ABI StepOne Plus系统购自美国Applied Biosystems公司；细胞培养箱和NanoDropTM1000微量分光光度计购自美国赛默飞公司；酶标仪购自美国 Biotek公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人PC3细胞使用含10%FBS和1×青链霉素液的RPMI-1640培养基，培养于37 ℃含5% CO2的培养箱中。

1.2.2稳定转染细胞株的建立和实验分组 慢病毒感染在24孔板中进行，每孔接种5×104个PC3细胞，培养16 h。用含10%FBS的RPMI-1640培养基稀释慢病毒，同时加入终浓度为10 mg/L的聚凝胺，每孔加入2 ml稀释的病毒液使得感染复数(multiplicity of infection, MOI)为20，于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养24 h，随后换成新鲜培养基继续培养72 h，换成含嘌呤霉素的培养基持续培养2周，筛选出稳定表达miR-143的PC3细胞，记为PC3/miR-143组，同时筛选出感染对照慢病毒的PC3细胞，记为PC3/miR-NC组，在荧光显微镜下观察细胞是否表达绿色荧光，通过Real-time PCR检测细胞中miR-143的表达水平。以未转染的PC3细胞记为PC3组。使用Lipofectamine 3000将pCNDA3.1和pCNDA3.1-TFF3质粒分别转染PC3/miR-143组的细胞，分别记为PC3/miR-143+ pCDNA3.1组和PC3/miR-143+ pCDNA3.1-TFF3组，转染操作步骤按照说明书进行。

1.2.3RNA提取和Real-time PCR 细胞中的总RNA通过TRIzol reagent提取，提取过程参考说明书进行。总RNA的纯度和含量通过NanoDropTM1000分光光度计检测和计算260 nm与280 nm处吸光度值的比值，以及260 nm与230 nm处吸光度值的比值来评价。使用 miScript II RT Kit将总RNA转录成cDNA，将1 μg总RNA加入到含12 μl DEPC处理水、2 μl miScript Reverse Transcriptase Mix、2 μl miScript Nucleics Mix和4 μl 5× miScript HiSpec buffer中，在37 ℃孵育60 min后，95 ℃孵育5 min，终止反应，冻存于-20 ℃备用。对于miR-143的表达水平检测使用Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit在ABI StepOne Plus系统上进行，反应条件：95 ℃、10 min为预变性阶段条件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40个循环。以U6作为内参，2-ΔΔCt法计算miR-143的相对表达量。对于TFF3 mRNA的定量检测同样在ABI StepOne Plus系统上进行，反应条件为95 ℃、10 min预变性；95 ℃、5 s，60 ℃、40 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。扩增使用的引物为TFF3 (genbank登录号: NM_003226)，(F)5′-CCAAGCAAACAATCCAGAGCA-3′，(R)5′-GCTCAGGACTCGCTTCATGG-3′；U6 snRNA (genbank登录号: NR_004394)，(F)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，(R)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH，(F)5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′，(R)5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.2.4细胞增殖活力检测 使用CCK-8试剂盒对不同组细胞的增殖情况进行分析。将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化后用未添加血清的培养基重悬，按照100 μl/孔(2 000个细胞)接种96孔板，饥饿培养12 h后更换完全培养基继续培养，于培养0、24、48、72、96 h时每孔分别加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h后通过酶标仪检测吸光度(A450)值。每组细胞进行6复孔检测。

1.2.5细胞凋亡检测 细胞凋亡分析通过AnnexinV-FITC Analysis Kit在流式细胞仪上进行，操作按照说明书进行。具体为各组细胞在相同的条件下培养48 h后用胰酶消化，2 555 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5～10万重悬的细胞，2 555 r/min离心5 min，弃上清液，加入195 μl Annexin V-FITC Binding buffer重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，室温避光孵育15 min，避光置于冰浴中，立即进行检测，使用Cell Quest software分析结果。

1.2.6生物信息学分析 从Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 数据库中获得2个分析PC中miRNA表达水平的数据集(GSE64333和GSE54516)，分析PC组织和癌旁组织中miR-143的表达水平。分别使用在线分析软件miRanda (http://www.microrna.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)和TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)预测 TFF3 3′-UTR中miR-143的结合位点，取三者的交集，构建荧光素酶报告基因质粒进行实验验证。

1.2.7双萤光素酶报告基因分析 分析miR-143与TFF3 3′-UTR的相互作用，构建野生型和突变型TFF3 3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pGL3-TFF3，以及预测与miR-143结合区域点突变的荧光素酶报告基因质粒Mut-pGL3-TFF3。将荧光素酶报告基因质粒、内参质粒(海肾素荧光)和miR-143同时转染HEK293细胞。48 h后根据双荧光素酶报告基因检测系统的说明书操作裂解细胞，加入发光液后在多功能酶标仪上检测结果。利用海肾素荧光作为内参照对结果进行均一化处理。

2 结果

2.1 miR-143在PC组织中表达水平对GEO数据库中数据集GSE64333和GSE54516分析显示，与癌旁组织相比，PC组织中miR-143的表达降低(P<0.000 1)。见图1。

图1 miR-143在PC和癌旁组织中表达水平分析A：数据集GSE64333中miR-143的表达水平；B：数据集GSE54516中miR-143的表达水平;与癌旁组织比较：****P<0.000 1

2.2 miR-143在不同细胞中的过表达通过荧光显微镜观察显示，在PC3/miR-143组和PC3/miR-NC组中均存在明显的绿色荧光，而在PC3组中未观察到荧光信号。Real-time PCR检测显示PC3/miR-143组中miR-143的表达量高于PC3组(t=8.877,P=0.000 9)和感染对照慢病毒的PC3组(t=8.358,P=0.001 1)。见图2。

图2 miR-143在PC3细胞中过表达的鉴定A：荧光显微镜观察不同组细胞中EGFP的表达 ×200；B：Real-time PCR检测不同组细胞中miR-143的表达水平；1：PC3组；2：PC3/miR-NC组；3：PC3/miR-143组；与PC3/miR-143组比较：**P<0.01

2.3 miR-143对PC3细胞增殖的影响通过CCK-8法检测各组细胞0～96 h增殖情况，结果表明，从48 h开始，与PC3组相比，PC3/miR-143组的增殖能力明显下降(F=167.8，P=0.009 5)；PC3/miR-NC组增殖能力未见改变。提示miR-143能抑制PC3细胞的增殖，见图3。

图3 miR-143对抑制PC3细胞增殖的影响与PC3组比较：*P<0.05；与PC3/miR-NC组比较：##P<0.01

2.4 miR-143对PC3细胞凋亡的影响流式细胞分析PC3组、PC3/miR-NC组和PC3/miR-143组的凋亡比例分别是(3.6%±0.5%)、(3.2%±0.7%)和(10.4%±1.7%)。PC3/miR-143细胞的凋亡比例高于PC3组(t=6.647,P=0.003)和PC3/miR-NC组(t=6.783,P=0.003)。提示miR-143在PC3细胞中具有促进细胞凋亡的作用。见图4。

图4 流式细胞术检测miR-143对PC3细胞凋亡的影响1：PC3组；2：PC3/miR-NC组；3：PC3/miR-143组

2.5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR抑制TFF3的表达情况生物信息学软件分析显示miR-143与TFF3的3′-UTR存在结合位点(图5A)；双荧光素酶报告基因分析显示，miR-143能够靶向作用于TFF3的3′-UTR抑制其表达，当对TFF3的3′-UTR中结合位点进行点突变处理后，miR-143的抑制作用消失(图5B、C)。Real-time PCR检测的结果显示，在过表达miR-143的PC3/miR-143组，TFF3的表达水平低于PC3组(t=6.417,P=0.002)和PC3/miR-NC组(t=6.322,P=0.002)(图5D)。

图5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR对TFF3表达的影响A：在线分析软件预测TFF3 3′-UTR中miR-143的结合位点；B：pGL3-TFF3和Mut-pGL3-TFF3荧光素酶报告基因质粒构建的示意图；C：双荧光素酶报告基因分析miR-143与TFF3 3′-UTR的靶向作用；D：Real-time PCR检测在PC3细胞中转染miR-143对TFF3 mRNA的表达水平的影响；与miR-143组比较：**P<0.01

2.6 TFF3抵消miR-143对PC3细胞增殖的抑制作用在PC3/miR-143组中转染TFF3真核表达质粒，通过CCK-8法检测各组细胞0～96 h增殖情况，结果显示，转染TFF3后PC3/miR-143组的增殖能力明显增加(F=120.9，P=0.008 7)，见图6。

图6 转染TFF3后miR-143对抑制PC3细胞增殖的影响与PC3/miR-143组比较：*P<0.05；与PC3/miR-143+pCDNA3.1组比较：##P<0.01

2.7 TFF3抵消miR-143对PC3细胞凋亡的促进作用流式细胞技术分析PC3组、PC3/miR-143组、PC3/miR-143+pCDNA3.1组和PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3组的凋亡比例分别是(4.6%±0.6%)、(11.2%±1.1 %)、(12.1%±1.5%)和(5.1%±1.2%)。PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3组的凋亡比例低于PC3/miR-143+pCDNA3.1组(t=7.244,P=0.001 9)和PC3/miR-143组(t=5.549,P=0.005 2)。提示TFF3能够抵消miR-143的促凋亡作用。见图7。

图7 流式细胞术检测TFF3对PPC3/miR-143细胞凋亡的影响1：PC3组；2：PC3/miR-143组；3：PC3/miR-143+pCDNA3.1组；4：PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3组

3 讨论

近十年来，越来越多的研究[4]证明miRNA在癌症的发展和进展中起着重要作用。miRNA表达水平异常与PC的发生有关，miR-9-5p能够抑制PC的增殖[5]，而miR-34a能够促进PC的转移[6]。在砷诱导获得癌表型的前列腺干细胞中，有几种miRNA的表达水平发生改变，其中miR-143的表达水平下降最明显[7]。提示miR-143参与了PC的发生，但其分子机制还不是很清楚。该研究对GEO数据库中关于PC miRNA表达水平的数据集GSE64333和GSE54516分析也表明，PC组织中miR-143的表达下降。本研究分析了PC3细胞中miR-143的作用，在PC3细胞中转染miR-143 mimics能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。生物信息学分析显示，miR-143可能靶向作用于TFF3基因的3′-UTR，抑制其表达。在本研究中Real-time PCR和Western blot的结果均显示在PC3中稳定表达miR-143能够抑制TFF3 mRNA和蛋白的表达。

TFF3是一种分泌肽，主要在胃肠道黏膜上皮中表达，参与肠道黏膜损伤后修复。除了参与黏膜修复外，TFF3还参与肿瘤细胞的侵袭转移和抗凋亡信号的激活。在乳腺癌[8]、胃癌[9]、胰腺癌[10]、结直肠癌[11]和PC[12]中均观察到TFF3的表达异常增加。Garraway et al[13]均报告TFF3在PC组织中高于正常前列腺组织(分别为42%vs10%和47%vs18.8%)，提示TFF3是PC的生物标志物。在PC细胞中过表达TFF3能够促进细胞增殖、侵袭和转移。本研究表明miR-143在PC3中表达降低，TFF3在PC3中表达增加。先前的研究提示在多种肿瘤中miR-143的表达水平均下降。在鼻咽癌中miR-143能够靶向作用于FMNL1，抑制肿瘤转移[14]；在骨肉瘤中miR-143能够靶向作用于FOSL2，抑制其肺转移[15]。一项研究[16]显示，在PC中，姜黄素能够上调miR-143的表达，抑制肿瘤的发生发展；此外，在去势治疗抵抗的PC细胞中下调TFF3的表达能够抑制细胞侵袭。另一项研究[17]显示，在PC细胞中下调TFF3的表达能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，增加放疗敏感性。本研究在稳定表达miR-143的PC3细胞中转染TFF3真核表达质粒，能够抵消miR-143的作用，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。上述结果表明在PC中miR-143可能通过靶向抑制TFF3的表达，发挥抑癌作用。

综上所述，该研究表明，在PC3细胞中过表达miR-143能够下调TFF3表达，发挥抑制PC细胞增殖作用；提示miR-143和TFF3基因是治疗PC的潜在靶点。后期还需要进行临床和体内实验，进一步明确miR-143和TFF3基因在PC中的作用机制。