曹旭东，张 帆，黄明月，陈 军，陈国安，陈小林

急性心肌梗死是全世界范围内危害人类健康的主要因素[1-2]。再灌注能降低心肌梗死患者病死率，但缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)损伤的存在，使患者仍有发展为心力衰竭的风险[3]。研究[4-5]表明，IR损伤的机制包括氧自由基、钙超载、细胞凋亡、坏死、自噬及内皮细胞功能障碍等。红景天苷(salidroside, Sal)是从红景天中提取的生物活性成分[6]。Sal具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老及神经和心血管保护作用[6-7]。内质网在蛋白质、脂质合成和钙调控中发挥作用。当内质网稳态被破坏时，会出现错误折叠和未折叠蛋白质堆积，触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[8]。ERS与多种心血管疾病有关，如心肌肥大、缺血性心脏病和心力衰竭[9-11]。因此，为了更好地探讨心肌IR损伤的机制并寻找潜在的保护药物，该研究采用大鼠离体心脏IR模型，观察Sal在IR损伤中的作用以及对细胞凋亡和ERS的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物48只8周龄SPF级雄性SD大鼠购买于南方科技大学实验动物中心，体质量280 g左右。在标准环境下饲养，所有操作均严格遵循实验动物使用规范和要求。

1.2 主要试剂Sal(根据相关文献[12]确定其药物浓度)、氯化三苯基四氮唑(TTC)购买于美国Sigma公司；RIPA购买于上海碧云天生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒购买于南京建成科技有限公司；TUNEL染色试剂盒购买于瑞士Roche公司；B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)及蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)、转录因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和转录活化因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和GAPDH抗体购买于美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗鼠和山羊抗兔二抗购买于武汉proteintech公司。心脏灌注液组分和含量(mmol/L)如下: KCl 4.6，KH2PO41.2，NaCl 120，NaHCO325，CaCl21.5，MgSO41.2，Glucose 11。先用95% O2/5% CO2的混合气向灌注液中通气30 min再开始实验，灌注液pH值7.35～7.45，温度37 ℃。

1.3 离体心脏模型和实验分组大鼠腹腔注射水合氯醛(10%, 0.3 ml/100 g)和肝素(500 U/kg)，麻醉后开胸，游离心脏后放入预冷的灌注液中，并将心脏转移至Langendorff灌流管口，用手术线固定。灌注液由主动脉口逆行灌注心脏，灌注压保持10.67 kPa。将含有液体的球囊经二尖瓣插入左心室，通过Labchart 7软件记录左室收缩峰压(left ventricular peak systolic pressure, LVSP)和左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。将各组心脏LVEDP调为0.67 kPa，使心脏稳定10 min。待其平衡后，随机分为4组(n=12)：对照(Control)组、Sal处理(Sal)组、缺血再灌注(IR)组和Sal处理缺血再灌注(IR+Sal)组。Control组,正常灌注150 min；Sal组,先用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注10 min，再用正常灌注液灌注140 min；IR组,缺血30 min，再灌注120 min；IR+Sal组，用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注1 min，缺血30 min，再用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注9 min，最后恢复灌注液灌注110 min。

1.4 心脏功能检测用Labchart 7软件实时监测左心室内压力的变化，实验过程中记录LVSP和LVEDP变化。LVSP、LVEDP代表心脏收缩、舒张功能。

1.5 心肌梗死面积检测实验结束后将心脏取下放入-80 ℃冰箱2 h，沿心尖到心底部的纵轴方向将心脏连续切成2 mm厚的薄片，每个心脏均选择第5片放入盛有2% TTC溶液的24孔板中，37 ℃避光水浴15 min；将染色完的心肌薄片用4%多聚甲醛避光浸泡2 d；数码相机拍照，死亡心肌组织呈白色，存活心肌组织呈红色，Image J测量白色区面积和心脏总面积。心脏梗死面积分数=(白色区面积/总面积)×100 %。

1.6 LDH活性检测按照LDH试剂盒说明书操作，收集缺血心脏复灌前10 min的灌注液，而Control组、Sal组心脏收集稳定灌注1 h后10 min内的灌注液。采用分光光度计读取各组灌注液的吸光度值并计算LDH活性。

1.7 TUNEL染色再灌注结束后，将心脏浸泡在4%多聚甲醛中固定；采用常规脱水、石蜡包埋和切片，并根据TUNEL染色试剂盒说明书处理标本，全程避光；激光共聚焦显微镜下观察染色情况，每张切片随机选取10个高倍视野，TUNEL阳性细胞的细胞核呈绿色，DAPI染核使细胞核均呈蓝色；TUNEL阳性率=绿色细胞核数/总细胞核数。

1.8 Western blot法检测蛋白表达再灌注结束后，快速将心脏冻存于-80 ℃冰箱备用。各组心脏称取相同质量的心肌组织，按照质量/体积比1 ∶4加入含蛋白酶抑制剂和RIPA的裂解液，冰上研磨并裂解30 min，放入4 ℃离心机，6 970 r/min离心20 min，取上清液分装，BCA法蛋白定量；配制SDS-PAGE胶，每孔加30 g蛋白，常规电泳和湿转法将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭120 min，将切好的条带分别与Bcl-2 (1 ∶1 000)、Bax (1 ∶1 000)、CHOP (1 ∶1 000)、PERK (1 ∶1 000)、ATF6 (1 ∶1 000)和GAPDH (1 ∶5 000)抗体孵育，4 ℃过夜；第2天，1×TBST室温洗膜3次，每次10 min，用山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室温孵育120 min，1×TBST室温洗膜3次，每次10 min；利用Bio-Rad发光仪和ECL显色液检测，Image J分析软件进行灰度值分析，GAPDH作为内参。

1.9 统计学处理使用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，实验结果用均数±标准差表示，各组间差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组之间的比较采用Tukey检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sal提高大鼠离体心脏IR后LVSP并降低LVEDP大鼠离体心脏左心室压力统计结果显示，Control组和Sal组LVSP和LVEDP差异无统计学意义；与Control组比较，IR组LVSP降低，而LVEDP升高(F=194.6，P<0.001)，差异有统计学意义；与IR组比较，IR+Sal组LVSP升高，而LVEDP降低(F=185.7，P<0.001)，差异有统计学意义。见图1。

图1 各组大鼠心脏功能的比较A：LVSP统计图；B：LVEDP统计图；与Control 组比较：##P<0.01；与IR组比较：**P<0.01

2.2 Sal减轻大鼠离体心脏心肌梗死面积和灌注液中LDH活性TTC染色和LDH试剂盒检测结果显示，Control组与Sal组心肌梗死面积分数和LDH活性无明显差异(P>0.05)；与Control组比较，IR组心肌梗死面积分数和LDH活性升高，差异有统计学意义(F=120，P<0.001)；与IR组比较，IR+Sal组心肌梗死面积分数和LDH活性降低，差异有统计学意义(F=444.5，P<0.001)。见图2。

图2 大鼠心脏梗死面积和LDH活性的比较A：心脏梗死面积图；B：心脏梗死面积统计图；C：LDH活性统计图；a：Control组; b：Sal组; c：IR组; d：IR+Sal组；与Control 组比较：##P<0.01；与IR组比较：**P<0.01

2.3 Sal抑制大鼠离体心脏心肌细胞凋亡蛋白的表达Western blot结果显示，与Control组比较，Sal组心肌细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表达差异无统计学意义；与Control组比较，IR组心肌细胞Bcl-2表达降低，Bax表达增加(P<0.001)；而与IR组比较，IR+Sal组心肌细胞Bcl-2表达增加，Bax表达降低(F=212.2，P<0.001)。见图3。

图3 大鼠心肌细胞Bcl-2和Bax表达的比较A：Western blot检测结果图；B：Bcl-2/Bax统计图；a：Control组; b：Sal组; c：IR组; d：IR+Sal组；与Control 组比较：##P<0.01；与IR组比较：**P<0.01

2.4 Sal抑制大鼠离体心脏心肌细胞凋亡率TUNEL染色结果显示，与Control组比较，Sal组心肌细胞TUNEL染色阳性细胞率差异无统计学意义(P>0.05)；与Control组比较，IR组心肌细胞TUNEL染色阳性细胞率增加(P<0.001)；而与IR组比较，IR+Sal组心肌心肌细胞TUNEL染色阳性细胞率降低(F=109.1，P<0.001)。见图4。

图4 大鼠心肌TUNEL阳性细胞率的比较 ×200a：Control组; b：Sal组; c：IR组; d：IR+Sal组；与Control 组比较：##P<0.01；与IR组比较：**P<0.01

2.5 Sal抑制大鼠离体心脏心肌细胞ERS蛋白表达如图5所示，Western blot结果显示，与Control组比较，Sal组ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表达差异无统计学意义；与Control组比较，IR组PERK、ATF6和CHOP的表达增加(F=190，P<0.001)；而与IR组比较，IR+Sal组PERK、ATF6和CHOP的表达降低(F=88.7，P<0.001)。

图5 大鼠心肌细胞ERS相关蛋白表达的比较A：Western blot检测结果图；B：PERK、ATF6、CHOP相对表达量统计图；a：Control组; b：Sal组; c：IR组; d：IR+Sal组；与Control 组比较：##P<0.01；与IR组比较：**P<0.01

3 讨论

及时重建堵塞冠脉的血流是实现挽救缺血心肌细胞和减小心肌梗死面积的最有效方法。然而，再灌注是一把“双刃剑”，除了能提供氧气和营养物质恢复细胞代谢并清除细胞代谢副产物外，其本身也会引起新的心肌细胞死亡，进一步加重心肌损伤[4]。到目前为止，临床上还没有较好的预防或治疗再灌注损伤的方法和药物。

Sal作为红景天的重要活性成分，大量研究[6-7]证实了其在抗炎、抗氧化、清除自由基、抗衰老及神经和心血管保护中的作用。结果表明，在大鼠离体心脏IR模型中，Sal能增加LVSP，降低LVEDP，改善心脏功能；同时，Sal还能减小心肌梗死面积和LDH活性，这些结果进一步证实了Sal在心脏IR损伤中具有保护作用。而细胞凋亡是心肌IR过程中一种重要的细胞死亡方式，并且已经成为了IR损伤的一个重要病理因素[13]。在细胞凋亡过程中会出现抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少、凋亡蛋白Bax表达增加及DNA片段化现象[14]。本研究结果显示，Sal增加离体心脏IR损伤中Bcl-2表达，降低Bax表达和TUNEL染色阳性细胞数，表明Sal可以抑制IR中发生的细胞凋亡。

ERS是由蛋白错误折叠、Ca2+储存过量、氧化应激、缺血和脂质代谢紊乱等病理因素引起的，未折叠蛋白反应可以激活内质网整合膜蛋白PERK和ATF6，进而启动ERS[8]。另外，ERS蛋白CHOP可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进凋亡蛋白Bax和Bim的表达[15]。本研究结果显示，Sal降低IR中ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表达，表明Sal能够抑制心脏IR触发的ERS损伤，提示Sal可能通过抑制ERS减轻心脏IR损伤。

综上所述，Sal可以改善大鼠离体心脏功能，减小心肌梗死面积，减轻心脏IR损伤，而这一保护作用可能与抑制细胞凋亡和ERS有关。这些结果表明Sal是一种潜在的临床防治IR损伤的药物，并为Sal的临床应用提供了实验依据。