王玲，陈锐雯，陈敏惠，叶明强，陈飞平，戚英伟，罗政，戴凡炜，吴继军，袁兆飞，陈于陇*

（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）（2.广东全农农业科技投资有限公司，广东东莞 523290）

菜心（Brassica campestrisL. ssp.ChinensisMakino），是华南地区栽培广泛的茎、叶、花同食类蔬菜，富含丰富的Vc、氨基酸、黄酮类等营养物质，深受消费者青睐[1]。菜心采收时从基部切割，机械损伤严重，易造成采收后茎部失水、空心、木质化等问题，加速采后菜心的品质劣变，限制菜心的贮运销售。因此，研究菜心茎部衰老木质化的机理，探索适宜的保鲜方法以延长采后菜心的货架期亟待加强。目前，菜心采后品质调控的保鲜报道主要通过预冷[2]、低温贮藏[3]、化学保鲜[4]、气调包装[5]等对叶片黄化延缓效果，以及从转录调控水平探讨菜心叶片贮藏期衰老黄化机理[6-9]。同时，部分研究注意到贮藏期菜心茎部硬度增加，发生空心、木质化现象[10,11]，但并未对菜心采后茎木质化等衰老问题进一步的研究。因此，研究菜心采后茎部品质劣变，尤其是木质化、空心化等劣变衰老的发生及调控机制对探索针对性的贮藏保鲜技术具有重要意义。

过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的重要组成之一，是在植物体内参与胁迫应答传导、生理调节和激素信号等多代谢途径的重要信号分子[12]。研究报道外源施用H2O2可形成氧化胁迫，激活植物体内H2O2信号，可提高抗氧化和抗逆性[13,14]，例如1.0 μmol/L H2O2预处理的铝敏感型黑豆幼苗，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性增加，SOD基因（Mg/Fe-SOD和Mn-SOD）的表达水平提高，提高对铝的胁迫性[15]；水稻细胞-水稻白叶枯病菌互作体系，外源添加H2O2胁迫条件，显著地诱导了过氧化氢酶（catalase，CAT）相关基因表达，活化H2O2降解途径[16]。研究发现施用低浓度的H2O2可延长果蔬贮藏期，具备无污染、无残留等优势[17]。利用外源H2O2处理“黄冠”梨研究发现，20 mmol/L的H2O2抑制了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性，不同程度提高了POD、SOD、CAT、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力[18]。真空渗透10 mmol/L H2O2结合冷激处理番茄，诱导的果实内H2O2含量的升高和谷胱甘肽转移酶的提高[19]，20 mmol/L H2O2处理香蕉，提高了SOD和POD活性，抑制CAT活性，H2O2在果皮中积累增加[20]，1.96 mmol/L H2O2处理降低了龙眼果皮CAT、SOD、APX等ROS清除酶活性[21,22]，0.1 mmol/L的H2O2浸泡草莓后，H2O2含量上升，CAT活性和APX活性下降[23]。以上研究结果表明，不同浓度H2O2处理对采后果蔬品质影响作用不同，对果蔬贮藏期品质变化具有重要的调控功能。此外，在菜心采后衰老研究中，Tan等[24]研究发现褪黑素处理采后菜心延缓叶片衰老，其重要机制是由于抑制呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，Rboh）基因催化ROS产生，提高了ROS清除酶系统酶活性、上调抗坏血酸-谷胱甘肽代谢途径（AsA-GSH）等，清除H2O2，该研究结果表明ROS含量变化及其调控机制在菜心采后衰老过程中具有重要作用。

植物组织木质化是生长发育及衰老的重要生理现象之一。菜心薹茎的木质化表现为薹茎硬度增加、空心等现象、极大地影响采后品质及商品价值。木质素的生物合成途径已经研究得比较清晰，包括苯丙烷类代谢、木质素合成特异途径，单体聚合过程，并且H2O2和O2参与此过程[25]。然而，果蔬采后木质化进程中H2O2对木质素生物合成的具体调控研究尚缺乏详细研究报道。本文主要研究了外源H2O2处理对菜心贮藏过程中呼吸速率、木质素、内源H2O2、木质素合成酶活性及其生物合成关键调节基因的相对表达水平等变化情况，初步探讨H2O2对菜心薹茎木质化发生的影响及其调控机制，为进一步阐明H2O2调控菜薹木质化机理并探索有效的、针对性的贮藏保鲜技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究选取受广大消费者喜爱的嫩食性的宁夏菜心为研究材料，选取播种育苗后约60 d的新鲜菜心，在1～2 h内快速运回实验室。实验用菜心选取无机械损伤，单菜心长度、茎粗细均匀的新鲜菜心，存放于4 ℃预冷1～2 h备用，进行后续保鲜实验研究。

主要试剂：上海源叶生物科技有限公司的甲硫氢酸（MET）、愈创木酚、氧化型辅酶Ⅱ、反式肉桂酸、肉桂酸（cinnamic acid）；南京建成生物工程研究所研发的H2O2试剂盒；南京奥多福尼生物科技有限公司的苯丙氨酸；天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取试剂盒；湖南艾科瑞生物工程有限公司的反转录试剂，荧光定量PCR试剂等。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计，日本岛津；水浴锅，澳华仪器有限公司；冷冻高速离心机，美国赛默飞世尔科技；便携式二氧化碳检测仪，中国上海本杉仪器设备有限公司；荧光定量PCR仪，伯乐生命医学（上海）有限公司；多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

将选取好的菜心分作两组，一组作为对照组完全没入清水（水温20 ℃）中浸泡处理15 min，捞出；另一组菜心为处理组没入5 mmol/L的H2O2水溶液15 min，捞出；然后晾干菜心表面水分，每500 g装入PE袋包装，放入4 ℃低温贮藏。在预实验研究中配制了0、5、15、20、25 mmol/L H2O2浓度处理菜心，发现5 mmol/L H2O2处理能明显导致菜心品质劣变，木质化程度加剧。为研究H2O2在木质化品质劣变的作用，因此在本实验中使用了5 mmol/L H2O2处理菜心。分别于0、3、6、9、12 d取样，测定呼吸速率，取菜心从上往下数展开叶片第4片至6片叶之间茎部组织，液氮速冻，存-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 呼吸速率测定

将菜心从包装袋取出称重，并将二氧化碳检测仪一起放入密封罐中密封，每隔1 min记录一次CO2浓度。根据CO2浓度变化、密封罐容积、样品鲜重、密封时间计算呼吸速率，以mg CO2/(kg·h)为单位。

1.3.3 木质素含量测定

主要参考Huang等[26]方法，称取茎部样品，利用乙醇溶液沸水浴直至无色，收集沉淀、干燥，溴化乙酰-冰醋酸溶解，恒温水浴，加入氢氧化钠溶液终止，在280 nm处测样品提取液吸光值。称取碱性木质素作为标准物，进行实验处理绘制标准曲线计算含量，用mg/g鲜重表示。

1.3.4 H2O2含量测定

参照H2O2试剂盒测定说明书（南京建成生物工程研究所）进行测定。称取茎部组织粉末，加入缓冲液提取H2O2，配制反应液混匀后，在405 nm处测定吸光度并计算H2O2含量，用μmol/g鲜重表示。

1.3.5 木质素各合成酶活性测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性测定参考Lisker等[27]的方法：称取1.5 g茎部组织粉末，加入3.5 mL pH 8.8硼酸-硼砂缓冲提取液[含少量聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）]，震荡混匀，低温离心30 min，取上清液，测定PAL活性。每个样品分别取两份0.5 mL酶液，一份作为样品管，另一份煮沸5 min失活作为对照管。然后，分别加入3.0 mL缓冲液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液，混匀。反应液置于80 ℃温水浴，盐酸终止反应。测定290 nm处的吸光度值。计算PAL活性，以每克样品每小时酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个PAL活性单位（U）。计算公式如下：

式中：

OD样品——样品管反应溶液的吸光度值；

OD对照——对照管反应溶液的吸光度值；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

t——酶促反应时间，h；

m——样品质量，g。

4-香豆酸辅酶A连接酶（4-Coumarate-CoAligase，4-CL）活性测定参考Knobloch等[28]的方法，称取茎部组织粉末，加入pH 7.8 Tris-HCl提取缓冲液及少量β-巯基乙醇，低温离心，取上清。取50 µL酶液加入5 mmol/L ATP、5 mmol/L MgCl2、0.33 mmol/L CoA（辅酶A）、0.2 mmol/L 4-香豆酸，适量缓冲液配制3 mL反应体系，37 ℃恒温水浴10 min，加入30%三氯乙酸终止反应，以恒温水浴前加入1 mL 30%三氯乙酸溶液的反应液作为对照，于333 nm测吸光值。计算4-CL酶活性。计算公式：参照PAL的计算方法计算4-CL活，以每克样品每小时酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个酶活单位（U）。

肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcoholdehydrogenas，CAD）活性测定参考Goffner等[29]的方法，称取茎部组织粉末，加入适量磷酸缓冲提取液及少量β-巯基乙醇、PVPP、氧化型辅酶Ⅱ震荡混匀，离心，取上清。3 mL酶反应体系（含10 mmol/L氧化型辅酶Ⅱ，5 mmol/L反式肉桂酸），200 µL粗酶液，对照管反应管加200 µL磷酸提取缓冲液，30 ℃水浴30 min，1 mol/L HCl终止反应后，于340 nm处测吸光值。酶活性以每小时每克吸光度变化0.01为1个酶活单位。参照PAL的计算方法计算CAD活性，以每小时每克菜心样品酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个CAD活性单位（U）。

过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定参考Fang等[30]的方法，称取茎部组织粉末，加入适量磷酸提取缓冲液，离心，取上清液。取一支试管，按顺序先加入2.0 mL磷酸缓冲溶液和0.5 mL 0.05 mol/L愈创木酚溶液，再加入0.5 mL现配的2% H2O2溶液，最后加入适量的酶溶液，倾倒混匀，用动力学模式测定在波长470 nm处的吸光值。隔1 min再记录一次。重复三次。制作OD470值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470，计算公式如下：

式中：

△OD470——每分钟反应吸光度变化值；

OD470F——反应混合液吸光度终止值；

OD470I——反应混合液吸光度初始值；

tP——反应终止时间，min；

tI——反应终止时间，min;

计算POD酶活性。以每克果蔬样品(鲜重)每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位。计算公式：

式中：

V——样品提取液总体积，mL；

VS——测定时所取样品提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

1.3.6 实时荧光定量PCR

RNA提取：利用提取试剂盒，参照说明书步骤[天根生化科技（北京）有限公司]。取0.1 g组织样品，加入500 µL裂解液后迅速震荡摇匀，经过离心、洗脱、沉淀总RNA，保存备用。

将提取的RNA用多功能酶标仪微孔板进行RNA浓度检测。采用艾瑞科生物公司反转录试剂盒（Evo M-ML V Kit with gDNA Clean for qPCR II）将1 µg RNA反转录合成得到cDNA，进行荧光定量PCR扩增分析。配制20 µL qPCR反应体系。根据参考文献选取GAPDH为内参基因[31]。荧光定量PCR引物设计参考实验室测定的转录组数据（表1），参考说明书进行运行程序设定。每个样品3次重复。目标基因的相对表达量通过利用2-∆∆CT公式的计算方法进行计算[32]，得到的表达量数据经过log2转换后，用Tbtools绘制热图分析[33]。

1.3.7 数据处理与分析

实验均重复3次，Excel 2013进行数据整理、Origin Pro 9作图，SPSS 23.0数据处理软件对测定的数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 H2O2处理对菜心呼吸速率的影响

如图1，菜心采后呼吸速率变化呈现先升高后下降的趋势，H2O2处理菜心在第3 d出现呼吸峰，为199.31 mg/(kg·h)，在贮藏3～9 d内呼吸速率都处于较高水平为187.87～199.31 mg/(kg·h)；而对照组在第6 d达到高峰，呼吸峰值为164.72 mg/(kg·h)。采后菜心经5 mmol/L H2O2处理，贮藏期间的呼吸速率均显著性高于对照组（图1）。植物组织的呼吸速率上升将导致各生理活动的快速变化，各营养物质如糖类、淀粉消耗加快，呼吸电子传递链等生理效用发生改变。Lin等[34]报道，H2O2处理龙眼增加呼吸强度，对照组和H2O2处理组在贮藏期6 d达到呼吸高峰，但对照组呼吸速率明显低于处理组，在本研究中，H2O2处理增加了呼吸强度，并提前了呼吸峰的出现，推测H2O2处理增加呼吸作用，可能引起菜心在采后贮藏过程中营养品质的下降。

2.2 H2O2处理对菜心茎木质素含量的影响

菜心采后叶片黄化衰老与茎木质化是影响其采后品质劣变的主要因素。菜心茎部木质素积累导致硬度增加，口感“变粗”[35]。如图2所示，随着贮藏时间的延长，菜心茎组织的木质化现象加剧，木质素含量不断增加，H2O2处理显著性地促进木质素含量积累，在贮藏期12 d时，H2O2处理组木质素含量达到11.27 mg/g，相比0 d增加了5.86 mg/g，而对照组仅增加到8.30 mg/g，处理组比对照组高了35.78%。H2O2参与木质素的聚合和沉积过程，是木质化过程的关键调节步骤[25]。Wang等[10]通过基因表达和蛋白组学研究发现，采后菜心茎部木质化与硬度呈正相关性（r2= 0.90，p<0.01），并且伴随着H2O2含量发生改变，高氧气调包装处理减缓菜心茎部木质化，诱导抗氧化酶积累，缓解ROS快速积累。任艳芳等[12]研究发现适宜浓度H2O2处理小白菜降低O2－·产生速率及H2O2含量，缓解盐胁迫。而在本研究H2O2处理加剧了木质素含量的增加，可能增加了内源ROS含量导致品质劣变快速发生。

2.3 H2O2处理对菜心内源H2O2含量的影响

活性氧在采后果蔬品质劣变中具有重要的调节作用。正常生长状态下，植物组织ROS作为重要的信号物质，维持正常生长和对抗环境胁迫；但在衰老、失水、病原菌侵染等逆境胁迫下，ROS平衡系统失衡，果蔬体内会积累超量的ROS物质，加速果蔬采后衰老[36,37]。由图3所示，H2O2处理组的菜心茎部组织内H2O2含量随贮藏时间不断增加，贮藏12 d时，H2O2含量为30.82 mmol/g，比对照组高2.71倍，对照组的H2O2含量在贮藏6 d最高（19.02 mmol/g）后开始下降；处理组的内源H2O2含量均显著高于对照组（p<0.01），5 mmol/L H2O2处理增加了茎部组织内源H2O2含量。Lin等[34]报道H2O2处理增加了龙眼果皮ROS产生，ROS清除酶活性降低，加速龙眼果皮褐变。庞学群等[20]研究发现一定浓度的H2O2处理香蕉，加速了内源H2O2积累，并且增加ROS清除酶超氧化物歧化酶（SOD）和POD活性，但降低氧化氢酶（CAT）活性。刘欢等[23]也发现H2O2处理草莓，H2O2含量高于对照组，在贮藏3～4 d达到最大值。由此可见，H2O2处理增加果蔬贮藏期内源H2O2含量，外源H2O2处理可能打破了组织ROS产生与清除的平衡状态，引起相关生理状态发生改变。

2.4 H2O2处理对菜心木质素合成酶活力的影响

木质素生物合成受多种关键合成酶的调节[38]。PAL和4-CL是参与苯丙烷代谢途径的重要酶，合成木质素前体物质。PAL酶活力先上升后下降，对照组在贮藏第6 d，酶活力值最大，为51.33 U/g，但比处理组（62.84 U/g）低18.31%，而H2O2处理组在贮藏第9 d，达到峰值为74.67 U/g，比对照组（40.21 U/g）高85.70%，在贮藏6～9 d均显著高于对照组（p<0.05）（图4a）。与PAL不同的是，4-CL活性逐渐上升，尤其是9 d后快速升高；在贮藏12 d H2O2处理组（196.77 U/g）的4-CL活性显著高于对照组（160.77 U/g）酶活性22.39%（图4b）。PAL、4-CL主要负责参与类黄酮、木质素等下游产物生物合成的前体物质的产生。罗政等[39]发现在采后菜心常温贮藏过程中，PAL酶活性在贮藏3 d达到峰值，随后下降；本实验在低温贮藏环境，两组处理分别在贮藏6 d、9 d酶活力值最大，随后下降，低温环境下酶活力变化被延迟。孙涵等[40]研究双宝蘑菇木质化进程中，4-CL酶活力不断上升，与木质素变化积累一致，认为，4-CL与木质素合成显著相关；本研究中，H2O2处理组4-CL酶活力持续上升，木质素含量不断升高，与该结果一致。Hu等[41]利用反义抑制技术下调杨树4-CL基因，木质素含量减少45%，也证实4-CL是木质素合成的重要参与者。在菜心采后贮藏过程中，H2O2处理通过促进PAL、4-CL活力，影响木质素合成前体物质的产生，促进木质素合成速率。

CAD在木质素单体形成的最后步骤起重要调节作用，CAD酶活水平上升是木质化的标志[42]。在本研究中发现对照组和H2O2处理组均在贮藏3 d（240.67 U/gvs263.33 U/g）和9 d（234.00 U/gvs270.33 U/g）酶活力较高，H2O2处理组分别提高了9.41%，15.53%，在贮藏6 d和12 d时，处理组和对照组酶活力值都有所下降，H2O2处理促进CAD酶活增加，加快了木质素单体物质的合成（图5a）。Kováčik等[43]报道认为ROS水平的减少降低了Cu诱导的洋甘菊根部木质化，主要归因于抑制CAD酶活性，ROS水平与CAD酶活性变化趋势具有一致性，在菜心组织中作为ROS主要形式之一的H2O2影响CAD酶活性。

POD主要是参与木质醇单体脱氢聚合。由图5b可知，H2O2处理组POD活力在贮藏期有所上升，保持较高的酶活性，在贮藏3 d时，H2O2处理组酶活性最大170.33 U/g，比对照组（140.95 U/g）高20.84%，在贮藏12 d时，H2O2处理组酶活性下降为128.22 U/g，比对照组低14.92%，对照组达到最大酶活性为150.71 U/g，对照组POD活性的升高速率相对于处理组较缓慢，H2O2处理促进POD活力在贮藏前期上升，贮藏后期下降。杨腾达等[44]报道在桑叶菜木质化过程中，真空预冷通过抑制贮藏后期（贮藏6 d后）POD酶活力变化，调节木质素的合成，而本研究中，处理组POD酶活力主要在贮藏前期（贮藏9 d前）高于对照组。外源褪黑素喷施茶树叶，加速了茶树叶木质素积累，发现处理8 d和16 d后，POD酶活性增加了2.04倍和3.79倍[45]；本研究中，处理组酶活性变化在贮藏3 d时变化最大，增加20.84%，变化差异相对于褪黑素处理茶树较小，可能与处理方式和品种差异相关，但也说明POD参与到木质素调节过程。

上述研究结果表明，H2O2处理可能通过加快PAL、4-CL、CAD、POD活力变化，因而导致菜心采后贮藏过程中木质素合成增加。Wen等[11]报道高氧气调包装通过抑制PAL、4-CL、CAD、POD活性来调控菜心采后木质化。Wang等[10]报道菜心H2O2与木质素含量积累之间存在相关性，采后贮藏过程中。在水稻中，发现H2O2与木质素同时大量生成抵御病原菌[46]。因此，外源H2O2处理可增加呼吸速率，内源H2O2产生，并影响木质素生物合成关键酶活性水平的变化，从而加快菜心采后茎组织木质化而导致品质劣变。

2.4 H2O2处理对菜心木质素合成酶基因表达的影响

木质素合成途径涉及多种酶参与，这些酶大部分都是综合性的酶类，参与植物体内多种生理生化反应，可受到外界环境刺激诱导参与植物木质化防御及衰老过程[47,48]。随着对木质素合成的不断探索，各合成酶基因被克隆、鉴定，研究发现PAL、4-CL、CAD、POD等都是由多基因家族编码，通过对其表达模式、功能调控的研究，发现各基因成员之间的功能机理存在着差异[49-52]。本研究以GAPDH基因为内参，参考课题组转录组数据，设计实时荧光定量引物，比较分析了9个PAL基因，3个4-CL基因，9个CAD基因，6个POD基因的表达差异。如图6所示，相对于其他木质素合成基因，POD37、PAL4、PAL8在对照组及处理组贮藏期内表达水平处于较高；PAL9、4-CL1、4-CL4、POD42、POD55在整个贮藏期表达量低；PAL3、PAL5、PAL6、CAD2、CAD4在对照组贮藏早期3 d表达量最高，在H2O2处理组则在贮藏6 d、9 d表达最强；PAL1、PAL2、CAD3、CAD11相对于对照组，在H2O2处理组3 d基因表达受到抑制；CAD7、CAD10、POD47在贮藏中期6 d、9 d表达较高，而H2O2处理组分别贮藏期3 d、12 d促进CAD7、POD47表达，CAD10在贮藏期6 d被抑制表达，；4-CL7、CAD1、CAD5、CAD6、POD31、POD63贮藏期内，对照组表达量较低，而在贮藏期12 d，H2O2处理组促进这些基因表达。

从以上结果得出，在采后菜心贮藏过程中，PAL、4-CL、CAD、POD在木质素合成途径各不同时段发挥功能，各基因家族成员表达模式不同，发挥各自不同的作用，在不同的贮藏期影响木质素合成。这与前人的研究报道是相似的，发现PAL多基因家族中，基因启动子序列的顺式作用元件不同，可能是受不同的转录调控机制，表现出不同成员的表达特异性[49]。在拟南芥At4-CL基因家族功能和表达特性也存在明显差异，与木质素的合成相关的At4-CL1和At4-CL2基因主要在维管束组织中表达；而At4CL-3与调控类黄酮合成相关，主要在花中表达[48]。已发现的多种植物CAD基因成员之间的功能机理存在着差异，多个CAD同时参与到木质素单体合成[50]。在植物体内，超级基因家族编码的POD参与到各个生命活动，而在植物木质化过程中，拟南芥、烟草中都已鉴定到其作为氧化剂催化H2O2共同参与木质素单体聚合[52,53]。因此，菜心采后贮藏过程中茎部木质素合成，表达丰度较高的POD37、PAL4、PAL8基因可能与木质素生物合成有重要关系。尽管如此，这些显著表达的基因是否作为主要调控基因参与到采后菜心茎组织的木质素合成，及H2O2处理在不同贮藏期诱导表达的差异基因与ROS信号途径的关系，尚需进一步进行功能验证及分析。

2.5 H2O2处理对ROS生成酶及清除酶基因表达的影响

植物中ROS的产生及信号途径受到呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，Rboh）的调控，Rboh是ROS的重要来源，由多基因编码。在本研究中，H2O2处理促进了RbohF，RbohB两个基因表达增强，抑制RbohG基因的表达。研究报道，在拟南芥组织中RbohD和RbohF表达诱导生成ROS，增强抗性[54]；在水稻组织中，OsRbohA与OsRbohE在免疫时期负责产生H2O2时间段不同，OsRbohA主要负责生成早期H2O2，而晚期H2O2的产生是OsRbohE生成[55]。可见，Rboh基因家族各成员在表达上的差异而影响H2O2的生成。PAO1和PAO2基因都是编码多胺氧化酶（PAO）的基因，多胺氧化酶催化多胺氧化降解成H2O2[56]，也是ROS产生的方式之一。本研究结果PAO1和PAO2基因表达丰度较低，不是主要的ROS产生基因（图7）。

植物体内本身具有一系列的ROS清除机制，ROS清除酶是重要的方式之一，包括POD、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等。通过对菜心SOD、CAT基因表达差异发现，H2O2处理增加SOD1、SOD2、SOD3、CAT3基因表达。刘建新等[57]研究也发现外源H2O2处理燕麦提高SOD、CAT、POD和APX酶活性，抗氧化能力增强。刘欢等[23]报道H2O2处理草莓增加了超氧阴离子产生速率，CAT活性下降。本研究结果显示H2O2处理增加了ROS清除酶基因的表达，RbohF、RbohB两个基因表达也增强。因此，我们推测H2O2处理激发了ROS清除酶系统的作用，但同时增加了H2O2含量生成的速率，而ROS清除酶系统并未表达达到清除过量的ROS的水平，导致H2O2含量增加。研究已表明，外源H2O2处理植物形成氧化胁迫，而适度的氧化胁迫激活内源H2O2，再经受各胁迫响应时，抗氧化防护能力增强[58-60]。可见，不同浓度的H2O2对植物本身的作用效果不同，表现出不同的生理生化效应。

3 结论

采后菜心木质化导致硬度的增加、质地变差、贮藏性能下降、严重影响口感和质量。本研究采用5 mmol/L H2O2处理菜心较对照组加速了呼吸速率，茎木质素含量增加了35.78%，内源H2O2含量上升2.71倍，可能引起采后菜心薹茎在贮藏过程中的加速衰老进程。进一步发现H2O2处理促进木质素代谢关键调节酶PAL、CAD、4-CL、POD等活性及其基因水平的变化；PAL、CAD活性在贮藏9 d比对照组酶活性分别提高85.70%、15.53%，4-CL活性在贮藏12 d比对照组酶活性分别提高22.39%，POD活性在贮藏3 d比对照组高20.84%。基因水平上分析发现贮藏期内茎木质素合酶基因POD37、PAL4、PAL8，活性氧生成酶基因RbohB、RbohG，活性氧清除酶基因SOD1、SOD2、SOD3、CAT3等表达丰度较高，H2O2处理提高了这些基因在不同贮藏时期内的表达。由此可见，5mmol/L H2O2处理菜心不利于菜心贮藏保鲜，H2O2对采后菜心木质化具有重要的调节作用。结合本研究结果推断外源H2O2调控木质素合成途径主要有：（1）内源H2O2积累，ROS清除酶系统也被激发，但无法及时清除大量的ROS导致ROS代谢失衡，积累的ROS作用于木质素单体聚合过程，加速木质素合成代谢；（2）ROS代谢失衡被认为是影响果蔬采后衰老的重要因素之一，易导致呼吸代谢紊乱，H2O2处理导致了采后菜心的呼吸代谢增加，并引起一系列衰老反应，加速了菜心木质化的进程。尽管如此，基于H2O2浓度效应对菜心采后品质劣变的调节作用及其分子调控机制尚待进一步研究。