苏晓丹，覃裕翠#，麦琬婷，陆建媚，韦妍妍，黄秋洁，叶 勇△

（1.广西医科大学药学院药剂实验教研室，南宁 530021；2.广西中医药大学药学院，南宁 530001）

秋水仙碱（Colchicine）又名秋水仙素，是从百合科秋水仙球茎和种子中提取的卓酚酮类生物碱，具有抗炎、免疫抑制和抗纤维化作用[1]，临床常用于防治急性痛风性关节炎[2-3]。秋水仙碱自身无毒，但其代谢产物二秋水仙碱具有极强毒性，易导致许多副作用发生，包括食欲不振、恶心呕吐、腹痛腹泻等[4]；且长期服用可致使肝肾功能损害，周围神经肌肉病变，骨髓抑制等严重药源性疾病[5-6]。长期临床实践表明，即使小剂量也会引起部分痛风患者不耐受，从而限制其临床的广泛应用。秋水仙碱毒副作用源于结合微管蛋白形成二聚体，同时抑制白细胞活化和迁移。除药物自身性质外，还与其在体内吸收、分布和代谢等活动有关。药物被吸收后，只有与血浆蛋白结合的游离药物才能通过生物膜并作用于靶器官发挥药理作用，因此测定药物与血浆蛋白的结合率在新药研发及临床研究中非常重要[7]。通过研究秋水仙碱的血浆蛋白结合率，对指导临床用药、设计合理给药方案具有重要意义，有助于提高药物安全性。测定血浆蛋白结合率方法有很多，如平衡透析法、微透析法、超滤法、超速离心法等[8]，都有各自的优缺点。微透析技术是一种收集待测组织细胞外液游离化合物的分析技术[9]，主要通过半透膜有特定相对分子质量截留值[10]来控制分子量大小达到透析目的[11]。与传统超滤法相比，既可实时分析[2]，也可体外分析[12]；药物浓度恒定；测定结果准确，在药代动力学研究中广泛应用[13]。本实验拟采用微透析法研究秋水仙碱与家兔、大鼠血浆的蛋白结合率，并与超滤法进行比较，同时验证微透析法能否成为秋水仙碱测定蛋白结合率的新方法，为秋水仙碱及其制剂的药效学和药动学提供理论资料，且为临床用药奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

微透析设备（Sweden CMA 公司）；微透析探针（MAB 7 Microdialysis Probe，膜外径0.6 mm，活性透析膜长度10 mm，分子量截留值为15 ku）；灌注器推进泵（CMA 402 Syringe Pump）；LC-15A高效液相色谱议（日本岛津香港有限公司）；灌注器（CMA 1.0 mL Exmire Microsyringe，MS-GAN100）；TG16-WS医用离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；电子天平（梅特勒—多利多，XS205DU）。

1.2 试剂与动物

秋水仙碱对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Q-006-181218）；甲醇（色谱纯）；超纯水；家兔、SD 大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK 桂2014-0002，使用许可证号：SCXK 桂2014-0003。

1.3 秋水仙碱高效液相色谱法（HPLC）测定的方法学考察

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶水（56∶44）；流速：1 mL/min；检测波长：352 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

1.3.2 溶液的配制（1）林格氏液溶液的配制：在纯水中溶解氯化钠8.599 1 g，氯化钙0.147 0 g 和氯化钾0.298 8 g，置于1 000 mL 容量瓶中，定容、过滤。滤液超声脱气后，即为林格氏液（Ringer's 液），备用。（2）血浆的制备：鼠血浆的制备：SPF 级SD 雄性大鼠，体重约200 g，负压抗凝管取腹主动脉全血，3 500 r/min离心15 min，分离血浆，混合保存（4 ℃）。（3）兔血浆的制备：家兔，耳缘静脉取血，用肝素抗凝，3 500 r/min 离心15 min，分离血浆，混合保存（4 ℃）。（4）磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制：称取十二水磷酸氢二钠9.51 g，氯化钠2.20 g，磷酸二氢钠1.04 g，至500 mL 容量瓶，加水溶解并稀释定容，即得pH 7.4 的等渗PBS。（5）对照品溶液的配制：取秋水仙碱对照品精密称定25.0 mg，取pH 7.4 PBS溶于50 mL 容量瓶中，震荡混匀，定容至刻度。即得500.0 μg/mL秋水仙碱对照品溶液，低温储藏，备用。1.3.3 精密度考察 取对照品溶液3种浓度15.612 5 μg/mL、49.960 0 μg/mL 和79.936 0 μg/mL 分别在1 d内连续进样6次，每次进样10 μL。另外，分别在6 d 内连续进样1 次，每次进样10 μL，考察日内和日间精密度。

1.3.4 标准曲线的制备 精密称取24.98 mg 秋水仙碱对照品，置50 mL 容量瓶中，用“1.3.2 项”下林格氏液溶解定容、振摇，即得浓度为499.6 μg/mL 贮备液。稀释贮备液，得到浓度为0.099 92 μg/mL、15.612 5 μg/mL、31.225 0 μg/mL、49.960 0 μg/mL、79.936 0 μg/mL、99.920 0 μg/mL对照品溶液。分别进样10 μL，测定峰面积，以对照品溶液质量浓度（C）比峰面积（A）进行线性回归，绘制标准曲线。

1.3.5 阴性干扰试验 将林格氏液灌满灌注器中，探针连接微灌注器，半透膜探针分别浸于大鼠、家兔空白血浆中，启动灌注泵，调节流速（2.5 μL/min），并在该流速下收集透析液（100 μL），进样分析，观察在该实验条件下秋水仙碱的保留时间位置是否有干扰。

1.3.6 反透析法测定探针体外回收率 在灌注器中灌满不同浓度秋水仙碱溶液（120 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL），探针连接微灌注器，半透膜探针浸于空白血浆中，启动灌注泵，调节流速（2.5 μL/min），每种浓度血浆平衡40 min，每60 min 间隔采样1 次。每种浓度血浆透析液连续收集3 份样品，进样分析。

1.3.7 探针体外回收率稳定性考察 测定蛋白结合率后，用浓度为125 μg/mL 秋水仙碱溶液灌流探针，将半透膜探针分别浸于大鼠、家兔空白血浆中，启动灌注泵，调节流速（2.5 μL/min），平衡40 min，每60 min间隔采样1次，分别连续收集8份样品，进样分析。

1.4 超滤膜回收率考察

取“1.3.2项”下秋水仙碱对照品溶液，稀释制备低、中、高浓度秋水仙碱PBS溶液，质量浓度分别为14.0 μg/mL、50.0 μg/mL、70.0 μg/mL，37 ℃水浴温育2 h。超滤管中放入300.0 μL温育对照品液，8 000 r/min 离心30 min 后超滤。取滤液进样分析，结果代入标准曲线A=25 794C-796.66，r=0.999 6 计算回收率。

1.5 微透析法测定秋水仙碱体外血浆蛋结合率

充分搅拌含药血浆，灌注器中灌满林格氏液，探针连接微灌注器，将半透膜探针分别浸于不同浓度秋水仙碱溶液（125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL）血浆中。透析时环境条件相同，启动灌注泵，调节流速2.5 μL/min，平衡40 min。相同条件下，每60 min间隔采样1次，连续收集3份样品，进样分析。

1.6 超滤法测定秋水仙碱体外血浆蛋白结合率

分别将120 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL的秋水仙碱对照品溶液与适量大鼠、兔血浆在37 ℃中水浴2 h，再分别取500 μL 于超滤管中，8 000 r/min 离心30 min，取超滤液进行HPLC 分析。每种浓度平行测定3次。

1.7 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，相同浓度下兔鼠体外血浆蛋白结合率超滤法组与微透析法组比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 秋水仙碱HPLC测定的方法学实验结果

2.1.1 专属性考察结果 在“1.3.1 项”色谱条件下，秋水仙碱的保留时间在5.5 min 左右，峰形良好，无杂峰干扰，有较好专属性，分析可行性高，色谱图见图1。

图1 秋水仙碱、空白血浆HPLC图谱

2.1.2 标准曲线的绘制 在“1.3.4 项”下以峰面积（A）比对照品溶液质量浓度（C）进行线性回归，得标准曲线方程：A=25 052C-6 613.6，r=0.999 7，表明秋水仙碱在0.099 92～99.920 0 μg/mL内呈良好线性关系。

2.1.3 精密度考察结果 对照品溶液日内精密度相对标准差（RSD）分别为0.36%、0.85%、0.92%，日间精密度RSD 分别为2.53%、1.74%、1.19%。精密度RSD均小于3.00%，可认定精密度考察结果良好。2.1.4 阴性干扰试验结果 阴性干扰试验结果显示，大鼠血浆和家兔血浆经过微透析后，在5.5 min左右的吸收对秋水仙碱测定没有影响。

2.1.5 探针体外回收率的结果 采用减量法测定和计算探针体外回收率，秋水仙碱体外回收率（RL）。RL=（C2-C1）/C2×100%。C1、C2分别为HPLC测定透析液中秋水仙碱的浓度和实验前灌流液含药林格氏液中秋水仙碱的浓度。结果在同一流速下，同种血浆RL不随血浆中药物浓度的大小改变，稳定性好。3种不同浓度血浆RL有一定差异，兔血浆平均回收率为46.43%，大鼠血浆平均回收率为35.46%，见表1、表2。

表1 秋水仙碱家兔、大鼠血浆RL n=3,±s

表1 秋水仙碱家兔、大鼠血浆RL n=3,±s

表2 125 μg/mL秋水仙碱兔、大鼠血浆RL稳定性考察n=2,±s

表2 125 μg/mL秋水仙碱兔、大鼠血浆RL稳定性考察n=2,±s

2.2 超滤膜回收率考察

秋水仙碱浓度为13.96 μg/mL、52.10 μg/mL、71.44 μg/mL 的回收率分别为（99.53±0.04）%、（99.99±0.13）%、（99.92±0.22）%，平均值为（99.88±0.20）%，超滤膜回收率实验表明回收率值均大于95%超滤膜对药物不存在特异性和非特异性吸净附，表明该方法结果准确可信。

2.3 超滤法和微透析法测定的秋水仙碱体外血浆蛋白结合率

微透析法的血浆蛋白结合率可由血浆中游离药物浓度求得，血浆中游离秋水仙碱的质量浓度（CY）。CY=CT/RL，CT、RL 分别表示透析液中秋水仙碱浓度和探针RL。血浆蛋白结合率（%）=（C0-CY）/C0×100%，C0为实验前含药血浆中秋水仙碱的实际浓度。超滤法、微透析法在相同种属的相同浓度下，低、中浓度秋水仙碱在大鼠血浆中的蛋白结合率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；低、中浓度秋水仙碱在兔血浆中的蛋白结合率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。结果显示，相同浓度下的秋水仙碱体外血浆蛋白结合率在大鼠、兔血浆中使用超滤法和微透析法差异不大，高浓度蛋白结合率偏低，兔体外血浆蛋白结合率比大鼠体外血浆蛋白结合率稍高。

表3 秋水仙碱在超滤法和微透析法中大鼠和家兔体外的血浆蛋白结合率n=3,±s

表3 秋水仙碱在超滤法和微透析法中大鼠和家兔体外的血浆蛋白结合率n=3,±s

与超滤法比较，*P＜0.05

3 讨论

血浆蛋白结合率是药动学的重要参数之一，影响药物的作用强度及时间，并与药物的相互作用及作用机制密切相关[14]。目前MD已逐渐应用于血浆蛋白结合率的研究，半透膜可控制分子量大小达到透析目的。采集到的样品则可在高效液相色谱仪等分析仪上直接进样分析，从而可以间接研究药物的血浆蛋白结合率，可实时分析也可体外分析，具有更高的分析效率，相对其他方法更有优势。

本实验超滤法测定秋水仙碱体外血浆蛋白结合率时，根据滤液体积及其性质，对温度、时间与转速进行考察。结果表明，在4 ℃和37 ℃下进行孵育时，两者血浆蛋白结合率无明显差异，因此本实验采用37 ℃温育。此外，在30 min时，秋水仙碱血浆蛋白结合率最高且耗时短；在无蛋白泄漏前提下，依照标准超滤液容积比总血浆容积在0.3～0.6间，故选择离心转速为8 000 r/min。

超滤法、微透析法在相同种属的相同浓度下，低、中浓度秋水仙碱在大鼠血浆中的蛋白结合率比较，差异均无统计学意义，在兔血浆中的蛋白结合率差异有统计学意义。这可能与种属差异有关，且两种方法高浓度蛋白结合率偏低，兔体外血浆蛋白结合率比大鼠体外血浆蛋白结合率稍高。但微透析法和超滤法结果差别不大，表明采用微透析法进行血浆蛋白结合率的测定是可靠的。

兔血浆蛋白结合率较大鼠血浆高，表明含药兔血浆的游离药物浓度比大鼠血浆稍低。可能是秋水仙碱与不同血浆蛋白结合存在种属差异，血浆或血清所含蛋白成分组成及含量不同导致的。此外，高浓度秋水仙碱与两种血浆蛋白结合率较低，可能是自身药物结构性质造成的，但具体原因待进一步考察。两种方法在测定秋水仙碱蛋白结合率结果没有显著差异，表明采用微透析法进行血浆蛋白结合率测定是科学可行的。

血浆蛋白结合率的高低不仅与药物、血浆性质有关，还与回收率有关。探针RL 的测定方法有多种，本实验采用减量法进行RL考察。在预实验时，用减量法和增量法测定探针RL，发现两者差别不大，鉴于实验的方便性，选用减量法完成了所有RL研究。但使用减量法前提是：外界条件相同[15]、实验环境一致、灌流速度一定。本实验结果中同种血浆回收率大小不随浓度发生变化，可认定回收率与药物浓度无关，与大多数研究回收率文献结果一致。

此外，本研究结果显示，不同浓度秋水仙碱的蛋白结合率有一定差异，特别是在低浓度时蛋白结合率相对较高。提示在低浓度给药时该化合物以游离型存在的量相对较少，在临床用药时应予以重视。