李绍宽，刘 静，赵 楠，庞民好，唐博文，赵 斌，刘颖超

（河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001）

玉米穗腐病是玉米常见病害，在世界范围内普遍发生。玉米穗腐病由多种病原菌侵染引起[1]，其中，拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）是玉米穗腐病的主要致病菌之一[2]。拟轮枝镰孢侵染玉米后会导致玉米品质下降、毒素污染等一系列问题，严重影响农产品安全和人畜健康[3-4]。伏马毒素是由拟轮枝镰孢产生的一种重要的有毒次级代谢物，目前累计发现了数十种伏马毒素，它们主要分为A、B、C和P 4 个类别，自然界中普遍存在的伏马毒素是FB1、FB2和FB，其中FB1占伏马毒素总含量的70%～80%[8-9]。有研究表明，伏马毒素破坏鞘脂生物合成，引起人类和动物的多种潜在健康问题[10-11]。玉米是主要的粮食作物之一，降低伏马毒素对于提升玉米品质以及保护食品健康安全具有重要意义。

嘧啶核苷酸是细胞重要的基础组成物质之一，在生物发育过程中起着重要作用。嘧啶合成途径是一种广泛存在于生物体的重要代谢途径，其中二氢乳清酸氧化酶（DHOD）催化嘧啶合成反应中的第4 步反应，也是该途径中唯一的氧化反应[12-13]，主要负责将二氢乳清酸氧化为乳清酸，然后催化脱羧最终生成尿苷酸，它是嘧啶核苷酸的前体物质[14]。乳清酸是生物体维持正常生命活动的重要物质。研究发现，乳清酸可以治疗黄疸、肝脏一般功能障碍、痛风，改进脑血管循环，增加吞噬细胞活性，提高组织再生能力等。嘧啶合成途径在生物的各种代谢反应，DNA、RNA 以及磷脂生物合成中均具有重要作用，目前已作为多种疾病的治疗靶点[15]。含羞草科植物中嘧啶的代谢物5-氨基尿嘧啶可以阻断有丝分裂的正常进行[16]。在医药领域，目前已有报道将DHOD 作为靶标来开发其特异性抑制剂，用于治疗利什曼原虫（Leishmania brasiliensis）、肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）、克氏锥虫（Trypanosomacruzi）以及烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等病原物侵染引起的疾病[17]。研究表明，在烟曲霉中嘧啶合成被抑制后，其分生孢子丧失萌发力从而丧失致病性[18]。虽然目前已有许多靶标人体致病性真菌DHOD基因的药物，但是关于植物致病真菌DHOD基因的研究报道却很少，伏马毒素的合成受到多种因素的调节及制约，尤其是基础代谢途径对其可能会有更加深远的影响。嘧啶合成作为基础代谢途径对于生物的各种代谢反应均有调控作用，有报道称植物会由嘧啶衍生出有毒的次级代谢物质来保护自身安全，所以嘧啶代谢途径相关产物在真菌中可能具有同样的作用，可能对拟轮枝镰孢产生伏马毒素有一定的影响[19-20]。伏马毒素作为镰孢菌的次级代谢产物，其合成是否受到DHOD基因的影响尚不清楚。目前，DHOD基因在植物病原真菌方面的研究较少，关于DHOD基因对真菌毒素合成的影响研究亦未见报道。鉴于此，通过同源重组技术获得拟轮枝镰孢DHOD基因敲除突变体，对突变体伏马毒素合成能力进行分析，明确DHOD基因在调控拟轮枝镰孢产伏马毒素过程中的作用，为伏马毒素污染的控制提供新的潜在靶点，为玉米中伏马毒素的污染治理提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

拟轮枝镰孢标准菌株FV7600、含有pUCATPH（携带潮霉素抗性基因）载体的大肠杆菌均由河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室保存并提供。

1.2 主要仪器和试剂

主要仪器：PCR 扩增仪（Applied biosystems）、高效 液 相 色 谱 仪（Agilent 1200）、Real-Time PCR System StepOne Plus（Applied biosystems）。

主要试剂：Fungal RNA Kit（Omega 生物技术有限 公 司），Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，上海翊圣生物科技有限公司），Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix（High Rox Plus，上海翊圣生物科技有限公司），FB1、FB2标准品（青岛普瑞邦生物工程有限公司），Q5 超保真DNA 聚合酶（New England Biolabs）。试验所用引物（表1）均由金唯智生物科技有限公司合成，FVEG-06288为拟轮枝镰孢中编码DHOD 的基因，FVEG-02866是编码bZIP结构域蛋白的基因，在本研究中被用作内参基因。

表1 试验所用引物列表Tab.1 List of primers used in the test

1.3 试验方法

1.3.1 DHOD 家族基因系统发育以及同源性分析

从NCBI 上获取不同物种的DHOD 氨基酸序列，利用MEGA 7.0 软件采用邻接法构建系统发育树进行分析，聚类树中节点处的置信度用1 000 次自举法（Bootstrap）来完成；使用DNAMAN 对镰孢菌分支的DHOD氨基酸序列进行同源性比对。

1.3.2 拟轮枝镰孢FV7600基因组DNA 提取 采用CTAB法[21]提取拟轮枝镰孢基因组DNA。

1.3.3DHOD基因敲除突变体片段构建 采用同源重组法构建DHOD基因敲除突变体。根据NCBI 中下载的基因序列设计构建突变体所需引物（表1，引物 名 称：FVEG-062881f，FVEG-062881r；FVEG-06288-HPHf，FVEG-06288-HPHr；FVEG-062882f，FVEG-062882r），从拟轮枝镰孢FV7600 野生型菌株中分别扩增得到同源片段，从pUCATPH 载体中扩增获得潮霉素抗性基因（HPH）片段。对得到的目的片段胶回收，采用融合PCR 方法[22]（所用引物名称：FVEG-062881f，FVEG-062882r）进行连接得到完整片段。

1.3.4 原生质体的制备与转化 原生质体的制备与转化参考孔祥久[23]的试验方法，得到的转化子培养5代后通过PCR以及RT-qPCR进行突变体鉴定。

1.3.5 拟轮枝镰孢DHOD基因敲除突变体伏马毒素产生量的测定 取马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L）上培养5 d 的拟轮枝镰孢野生型菌株FV7600 与突变体△FvDHOD，分别接种于羧甲基纤维素钠（CMC）培养基（羧甲基纤维素钠15 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸铵0.825 g、水1 L、酵母粉1 g、MgSO4·7H2O 0.65 g）中，25 ℃黑暗培养3 d 后，4 000 r/min 离心5 min，弃上清，使用无菌水清洗得到1×108个/mL 孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种到马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L）中，使孢子终浓度为1×106个/mL，25 ℃恒温黑暗培养，9 d 后测定其伏马毒素产量。通过抽滤的方法将菌丝和培养基分离，然后将菌丝用液氮速冻，冷冻干燥后称取菌丝质量；采用高效液相色谱（HPLC）荧光检测器（FLD）-柱后衍生法检测伏马毒素的含量[24]，每个处理设置5个生物学重复。

伏马毒素含量按以下公式计算：伏马毒素含量（mg/g）=样品峰面积×标准样品浓度×培养基体积/（标准样品峰面积×菌丝干质量）。

1.3.6 RT-qPCR 检测基因表达量 取1.3.5 中冻干的菌丝提取RNA，反转录为cDNA，以FV7600 野生型作为对照组，通过RT-qPCR 检测突变体中DHOD基因以及伏马毒素产毒相关基因（fum1、fum6、fum8、fum13）的相对表达量，每个处理设置3个生物学重复，通过2-△△Ct计算基因相对表达量[25]。

反转录反应条件：

（1）去 除 基 因 组DNA：5×gDNA digester Mix 3µL；模 板RNA 1 µg；RNase free ddH2O 补 足 至15µL。使用移液器轻轻吹打混匀，42 ℃孵育2 min。

（2）逆转录：在第一步反应管中直接加入5 µL 4×HifairⅢSuperMix plus，用移液器吹打混匀。

温度程序设置为：25 ℃5 min；55 ℃15 mim；85 ℃5 min。将反应产物放入-20 ℃保存，使用时对其进行10倍稀释。

RT-qPCR 反应体系（冰上配制）：Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 10 µL、Forward Primer（10µmol/L，引 物 为FVEG-06288qPCRf）0.4 µL、Reverse Primer（10 µmol/L，引 物 为FVEG-06288qPCRr）0.4µL、cDNA模板2µL、ddH2O 7.2µL。

RT-qPCR 反应程序：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃15 s，退火/延伸55 ℃1 mim，共40个循环。

1.4 数据分析

使用单因素AOVNA 分析中的Duncan’s法对基因表达量以及产毒量进行分析。

2 结果与分析

2.1 DHOD家族基因的系统发育分析及同源性分析

为了分析拟轮枝镰孢DHOD 的系统发育关系，从NCBI上获取了层出镰孢（Fusarium proliferatum）、尖 孢 镰 孢（F.oxysporum）、拟 轮 枝 镰 孢（F.verticillioides）以及牛肺线虫（Dictyocaulus viviparus）等DHOD 的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 软件采用邻接法构建DHOD 氨基酸序列系统发育树（图1A），可以看出，拟轮枝镰孢的DHOD 与镰孢菌的DHOD聚类到同一分支上。对镰孢菌分支上的DHOD 氨基酸序列进行同源性对比分析，结果（图1B）表明，拟轮枝镰孢与Fusarium avenaceum的同源性为86.99%，与Fusarium heterosporum的同源性为88.70%，与Fusarium oxysporum的同源性为97.23%，与Fusarium proliferatum的同源性为97.87%，与Fusarium subglutinans的同源性为97.87%。系统发育分析及同源性分析结果表明，DHOD基因在真菌中相对保守。

图1 DHOD氨基酸序列系统发育分析及同源比对分析Fig.1 Phylogenetic analysis and alignment of amino acid sequences of dihydroorotate oxidase

2.2 同源重组获得△FvDHOD突变体

利用同源重组的方法获得了4 株FvDHOD基因敲除突变体的转化子菌株（图2），将转化子和野生型菌株分别接种到PDA 培养基平板中，结果发现，转化子菌株色素颜色较野生型更深。在加入了潮霉素B 抗性的培养基上，野生型菌株不再生长而转化子菌株正常生长。以转化子和野生型菌株的基因组DNA为模板，分别对其前同源臂+抗性片段（引物为FVEG-062881f+FVEG-06288-HPHr）、后同源臂+抗性片段（引物为FVEG-06288-HPHf+FVEG-062882r）、潮霉素抗性基因片段（引物为FVEG-06288-HPHf+FVEG-06288-HPHr）、DHOD基因片段（引物为FVEG-06288yzF+FVEG-06288yzR）进行PCR 检测，结果如图3所示。由图3 可见，前同源臂+抗性片段大小为2 689 bp、后同源臂+抗性片段大小为2 802 bp、抗性片段大小为2 114 bp、DHOD基因片段大小为2 635 bp，根据电泳结果分析，得到条带与预期片段大小一致。

图2 拟轮枝镰孢野生型与转化子在PDA培养基上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of wild type and transformants of F.verticillioides on PDA medium

图3 拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体不同片段PCR产物电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of PCR products of different fragments from wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.3 △FvDHOD突变体RT-qPCR验证

利用RT-qPCR 技术对突变体DHOD基因表达量进行检测，结果表明，4 株△FvDHOD突变体的DHOD基因表达量均显著低于野生型，说明获得了DHOD基因敲除的突变体菌株（图4）。

图4 拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体中DHOD基因相对表达量Fig.4 Expression levels of DHOD in wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.4 拟轮枝镰孢伏马毒素合成能力

通过HPLC 检测拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体的伏马毒素生物合成量，结果（图5）发现，野生型拟轮枝镰孢的伏马毒素产量为（51.27±6.20）mg/g，4 个突变体伏马毒素产量分别为（5.99±0.48）、（5.68±0.88）、（1.37±0.15）、（5.23±0.86）mg/g，较野生型下降88.32%～93.56%。可见，DHOD基因与伏马毒素的生物合成呈正相关。

图5 拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体的伏马毒素产量Fig.5 Fumonisins production of wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.5 伏马毒素生物合成基因簇的表达

试验进一步通过RT-qPCR 检测了拟轮枝镰孢突变体中部分产毒相关基因（fum1、fum6、fum8和fum13，均正调控伏马毒素FBs 的生物合成[20]）表达。对野生型以及DHOD基因敲除突变体的fum1、fum6、fum8和fum13基因进行表达量分析，结果（图6）表明，DHOD基因敲除突变体中4 个基因的表达量均显著低于野生型，DHOD基因的敲除使伏马毒素合成相关基因的表达受到明显抑制，说明DHOD基因与伏马毒素合成相关基因的表达呈正相关。

图6 拟轮枝镰孢野生型与DHOD基因敲除突变体伏马毒素合成相关基因表达量Fig.6 Expression levels of fumonisins synthesis related genes in wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

3 结论与讨论

嘧啶合成途径是所有生物体中极为重要的一个基础代谢途径，嘧啶合成途径的代谢产物是生命体内多种物质的前体，嘧啶被分解成简单的代谢物，如其中的氮和碳会被回收到细胞代谢池中重新利用[26]。嘧啶核苷酸可以衍生为萜类和酚类化合物等多种生物合成的活性中间物，参与细胞内多个代谢途径。例如糖原合成过程中的UDP-葡萄糖，又是转化为UDP-木糖、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖等其他糖类物质的底物；以及磷脂合成过程中的CDP-乙醇胺、CDP-二酯酰甘油等[27]；在马铃薯块茎片培养试验中发现，乳清酸和尿嘧啶促进了UTP（尿苷三磷酸）、UDP（尿苷二磷酸）和UDP-葡萄糖的含量提高[28]；香豌豆氨酸是由尿嘧啶衍生出来的一种次生代谢物，用于抵抗微生物侵染[26]。嘧啶类化合物是合成DNA、RNA 和其他代谢物（如磷脂和糖蛋白）的重要前体分子[29]，与机体内大多数代谢途径均有联系，而DHOD基因所表达的二氢乳清酸氧化酶对于该途径具有十分重要的意义。

伏马毒素是拟轮枝镰孢等少数菌种所特有的次生代谢物质，对于拟轮枝镰孢是非常重要的。本试验构建了DHOD基因敲除突变体，并观察到突变体伏马毒素合成能力显著降低，并且毒素合成相关基因的相对表达量也呈显著下降的现象。伏马毒素是拟轮枝镰孢产生的有毒次级代谢产物，其合成受到伏马毒素合成相关家族基因簇（FUM）的调控[30]。本试验中，所检测的FUM 家族基因簇中的4个基因表达量在DHOD基因突变体中均受到明显抑制，且DHOD基因敲除突变体的伏马毒素合成量也明显下降，基于目前的试验结果可以得出，DHOD基因表达的二氢乳清酸氧化酶作为嘧啶合成的关键酶之一，对于拟轮枝镰孢中伏马毒素的产生具有非常重要的影响。当拟轮枝镰孢中DHOD基因表达受到抑制时，伏马毒素的产生量以及与伏马毒素合成直接相关的基因的表达量均受到明显的抑制作用，基于此，认为DHOD基因通过正调控伏马毒素合成基因簇的表达来调控拟轮枝镰孢伏马毒素的产生，但是嘧啶合成途径是否影响伏马毒素的合成还需要通过进一步试验进行探究。虽然本试验明确了DHOD基因影响拟轮枝镰孢伏马毒素的产生，与伏马毒素的产生具有正相关关系，但是具体如何调控伏马毒素合成基因簇的表达来调控伏马毒素产生仍未可知，需要进一步试验进行探究。

目前，以二氢乳清酸氧化酶作为靶标开发的药物已经出现很多，例如化合物奥落洛芬（Olorofim）已被证明对各种霉菌和多种真菌具有强大的体外活性，包括曲霉菌、球茎孢子菌、顶孢霉、拟青霉、短柄拟青霉、皮炎芽生菌、荚膜组织胞浆菌和球孢子菌等，尤其是对烟曲霉具有特异活性，可以使其失去致病力[31-32]。基于物种间的DHOD基因编码的二氢乳清酸氧化酶对于靶标药物具有不同的敏感性，可以开发特异性的DHOD抑制剂，例如发现一种吡唑类化合物对幽门螺杆菌具有抑制作用，但对其他革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或人类细胞的抑制作用较差，通过结构修饰对该化合物的侧链结构进行一些改变，提高了其对幽门螺杆菌的特异性抑制活性[33]。因此，通过靶向二氢乳清酸氧化酶来防治真菌病害及其次生代谢产物污染是可行的。本试验明确了DHOD基因影响拟轮枝镰孢伏马毒素的产生，但其具体是通过何种方式来正调控拟轮枝镰孢产毒还需要进一步试验进行探究。后期可以通过对野生型及突变体进行转录组测序等，进一步明确DHOD基因调控伏马毒素产生的机制，以及对已报道的抑制剂进行筛选，得到拟轮枝镰孢的特异性抑制剂。就目前结果而言，以拟轮枝镰孢中DHOD基因作为潜在药物靶标控制伏马毒素产生是具有可行性的。