罗 斐，袁颢宸，刁娟娟

（1. 山东中医药大学第一临床医学院，济南 250013；2. 山东中医药大学附属医院，济南 250011）

过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura，HSP）是一种以IgA沉积为主的系统性小血管炎［1］，在2～8岁儿童中最为多见，其发病率为3/100000～27/100000，且近年来逐年上升［2-3］，亚洲地区发病率高达70/100000［4］。临床以非血小板减少性紫癜、常伴关节肿痛、腹痛、胃肠道出血、血尿和蛋白尿为特征，临床分型有单纯皮肤型、腹型、肾型、关节型以及混合型紫癜［5］。HSP属于西医儿科学免疫性疾病，归属中医学“血症”范畴。其病因复杂，病理机制主要为B淋巴细胞和T淋巴细胞多克隆活化，分泌大量IgA沉积在全身小血管壁上，导致IgA相关免疫复合物增生性小血管炎。2012年，《国际血管炎分类标准》已将该病更名为IgA相关血管炎［6］。该病多为自限性疾病，预后良好，长期并发症是持续肾脏受累［7-8］。胃肠道和肾脏受累是其发病和死亡的主要原因［9］。现代医学对该病尚无特效疗法，临床以糖皮质激素和免疫抑制剂等对症治疗为主，虽可有效缓解患儿病情，但因其紫癜容易反复出现，病程周期较长，可出现紫癜性肾炎病变，导致治疗颇为棘手。众多研究表明，中医药治疗HSP疗效显著，预后良好，不良反应少，还可预防HSP患儿肾功能损害，降低复发率等［10-12］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是内源性非编码RNA。miRNA转录后水平调节基因表达，从而发挥多种生物学功能［13］。miRNA也常作为疾病诊断的潜在生物标志物［14］。生物信息学作为一门多学科交叉融合的综合学科［15］，已成为整个生物医学领域发展的重要组成部分及研究前沿［16］。

本研究拟通过生物信息学方法对GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的原始数据芯片进行miRNA差异性分析，挖掘差异性表达显著的miRNA，并预测其潜在靶基因与信号通路，通过关键基因预测具有治疗HSP作用的潜在中药，旨在揭示其可能的作用机制，为临床提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 GEO基因芯片数据分析HSP差异表达基因

以“Allergic Purpura”“Henoch-Schönlein purpura”“Purpura”为关键词，设置种属为“homo sapiens”，在GEO数据库［17］中进行检索，获得GSE80401基因表达谱，共包含16例样本基因芯片数据，其中病例组10例，对照组6例。基于GEO数据库的GEO2R工具分析病例组与对照组中差异表达的miRNA。以P＜0.05和|log2FC|＞2为标准筛选差异表达的miRNA，定义差异表达探针（负数代表下调，正数代表上调），然后以热图和火山图的形式进行输出。

1.2 HSP靶点的挖掘

GeneCard（http://www.genecards.org）［18］是一个能提供简明的基因组、蛋白质组、转录、遗传和功能上所有已知和预测的人类基因的综合数据库。以“Allergic Purpura”“Henoch-Schönlein purpura”为关键词，通过GeneCard数据库和OMIM数据库（http://www.omim.org）查询筛选，获得HSP的相关治疗靶点信息。

1.3 hsa-miR-3945靶基因预测

通过miRwalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.orhttp://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/g）、TargetScan（http://www.Targetscan.org）三个靶基因数据库分别预测hsa-miR-3945的靶基因，对三者的预测结果绘制venn图，得到交集基因。将上述基因与1.2中获取的HSP基因交叉映射，得到映射靶基因。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与Hub基因

将映射靶基因放在String数据库（https://stringdb.org/）［19］中构建蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）网络模型，选择物种为“homo sapiens”，设定最高置信度蛋白质参数评分≥0.9，其余参数保持默认设置，最终获得PPI网络图，以TSV格式输出，导出蛋白互作关系并导入Cytoscape 3.7.2软件中。利用Cytoscape 3.7.2软件的cytoHubba插件、MCODE插件对其进行分析，以边缘渗出组件（edge percolated component，EPC）分析方法、最大团中心性（maximal clique centrality，MCC）分析方法和最大邻居组件（mazimun neighborhood component，MNC）分析方法为标准筛选出Hub基因。

1.5 hsa-miR-3945映射靶基因的GO及KEGG信号通路富集分析

运用Metascape数据库（http://metascape.org/gp/#/main/step1）［20］分别对映射靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，设置种属为“homo sapiens”，设定阈值P＜0.05，筛选出最可能的前10名GO功能富集结果及前10条信号通路，以气泡图的形式输出结果。

1.6 关键靶点对接及中药预测

将筛选出的Hub基因导入Coremine Medical数据库（https://www.coremine.com/）［21］中，设置阈值条件为P＜0.05，由此筛选出与Hub基因相关的中药。根据阈值生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18的标准，利用TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）［22］对上述预测中药进行初步筛选，获取各药物相应的靶点蛋白，并通过Uniprot数据库进行校正、规范化，再将处理后的数据导入Cytoscape软件中构建“中药-有效成分-靶点”网络图。

2 结果与分析

2.1 差异基因

基于GSE80401的基因片段原始数据，符合|log2(FC)|＞2和P＜0.05标准的差异基因有83个，其中包括26个上调基因和57个下调基因，表明miRNA在正常个体与HSP患者之间存在差异性表达。差异性分析火山图为图1，热图为图2。其中显著表达的基因为hsa-miR-3945、hsa-miR-4430、hsa-miR-3158-5p、hsa-miR-4655-3p、hsa-miR-3667-5p。依据|log2(FC)|值排序筛选可知，hsa-miR-3945在样本中显著下调，可作为关键miRNA。

图1 差异基因火山图Fig. 1 Volcano map of differential genes

图2 差异基因热图Fig. 2 Heat map of differential genes

2.2 儿童过敏性紫瘢靶点挖掘

以“Allergic Purpura”“Henoch-Schönlein purpura”为关键词，利用GeneCard数据库和OMIM数据库查询筛选，去重整合共获得886个儿童HSP的基因靶点。

2.3 hsa-miR-3945靶基因预测

通过miRwalk、miRDB、TargetScan三个靶基因数据库预测hsa-miR-3945的靶基因，得到的靶基因分别为5038、237、3148个，三者交集为101个（图3）。因GSE80401基因表达谱只有16例样本基因芯片数据，采用小样本量数据分析可能产生偏倚，故将交集基因与2.2中获取的HSP基因映射交叉，得到映射靶基因85个。将映射靶基因上传至String数据库，设置蛋白种类为“homo sapiens”，最高置信度蛋白质参数评分≥0.9，隐藏游离蛋白以确保研究数据的可靠性，其余设置均为默认设置，导出TSV格式的蛋白互作关系，后导入Cytoscape 3.7.2软件PPI网络图（图4）。运用Cytoscape 3.7.2软件中的cyto-Hubba插件、MCODE插件筛选出Hub基因为JUN、TP53、RELA、TNF、MAPK1、IL6、FOS、AKT1、MYC。

图3 hsa-miR-3945Fig. 3 hsa-miR-3945

图4 PPI网络Fig. 4 PPI network diagram

2.4 hsa-miR-3945预测靶基因的GO及KEGG信号通路富集分析

将2.3中预测所得的85个映射靶基因上传至Metascape数据平台中，对其进行GO富集分析和KEGG通路分析，P＜0.05为差异有统计学意义。GO结果显示，hsa-miR-3945的靶基因主要富集在膜筏、转录调节复合物、含胶原的细胞外基质、过氧化物酶体等细胞组件中，参与细胞因子受体结合、转录因子结合、蛋白酶结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子功能，涉及细胞对脂多糖的反应、对无机物的反应、凋亡信号通路、对细胞外刺激的反应等生物过程。KEGG信号通路分析结果表明，hsamiR-3945的靶基因信号通路显著富集于IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化通路、NF-κB信号通路等通路中。富集气泡图结果如图5所示。

图5 富集气泡图Fig. 5 Enrichment bubble diagramBP：生物学过程；CC：细胞成分；MF：分子功能。BP: Biological process; CC: Cell component; MF: Molecular function.

2.5 关键靶点对接及中药预测

通过Coremine Medical数据库预测具有潜在治疗HSP的中药，设置阈值条件P＜0.05。预测结果显示，hsa-miR-3945的Hub基因与多种中药密切相关，如桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍。以上五种药出自桂枝茯苓丸，其中桂枝可散寒止痛，温通经脉；茯苓可安神健脾，利尿除湿；牡丹皮可活血化瘀，清热凉血；桃仁可润肠通便，活血化瘀；赤芍可化瘀消肿，清热止痛。用以上药物构建“中药-有效成分-靶点”网络图（图6），其中倒三角形代表基因，菱形代表药物，正六边形代表药物成分，A、B代表共有成分。

图6 “中药-有效成分-作用靶点”网络Fig. 6 “Traditional Chinese medicine-active ingredients-action target” network

3 讨论

本研究发现，hsa-miR-3945在多物种中具有高度保守性，可能作为一种新的治疗手段用以治疗HSP。GO富集结果显示，在hsa-miR-3945的差异表达中，其主要调节对脂多糖的反应、对无机物的反应、凋亡信号通路、对细胞外刺激的反应等生物过程；KEGG富集结果显示，其主要富集在IL-17信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化通路、NF-κB信号通路等。

蔡明阳等［23］的研究表明，miRNA在HSP的发病过程中发挥作用，miR-146a-5p、miR203-3p和miR-223-3p的相对表达水平与粒细胞浸润和纤维蛋白样坏死强度的相关性最高，let-7a家族可调节NF-κB信号通路［24］的激活，且参与狼疮肾［25］及IgA肾病［26］的发病。罗颖等［27］推测，HSP患儿外周血B细胞IL-10的表达与miR-21-5p有关。本研究所获得的hsa-miR-3945目前尚缺乏文献记载，仍需进一步的试验验证。

有研究表明，TNF-α等炎性因子参与了HSP的发病及免疫机制，可作为诊断诊治HSP的重要参考依据［28-30］。TNF的生物学效应基于TNF-α转换酶（tumor necrosis factor alpha converting enzyme，TACE）将其切割成可溶性分子［31-32］，并通过与两种受体TNFR1（CD120A）和TNFR2（CD120B）结合而发挥作用［33-34］。TNFR1在TNF信号通路中起主导作用，而TNFR2则在局部稳态过程中增强TNFR1的反应性［35-36］。TNF-α由单核巨噬细胞产出，是机体内主要的促炎因子，对机体免疫系统的稳定性具有重要作用，其高表达会诱导炎性因子的产生，导致微血管损害，从而引起皮肤紫癜等［37］。

Th17细胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-21等细胞因子，正常时具有抗感染、抗炎的免疫功能，已被确定为自身免疫的主要诱导剂，功能上调会引起炎症性疾病［38］。IL-17可以激活NF-κB、MP-KA和CEBP级联反应，影响上调促炎基因表达，造成肾血管内皮细胞损伤，导致肾小球和肾小管损害［39］。

NF-κB被证明参与机体免疫应答以及炎症急性期反应活动［40］，可调控TNF-α、IL-1β等多种炎症因子、趋化因子、黏附因子、集落刺激因子［41］。在病理状态下，其能够与细胞核结合，从而诱导各种趋化因子和细胞因子生成增加，以增强机体的炎性反应［42-43］。

在现代医学中HSP以对症治疗为主。剧烈腹痛伴消化道出血、关节肿痛或血管神经性水肿时可选择肾上腺糖皮质激素短期应用；紫癜性肾炎的出现如果符合肾病综合征标准或者急进性肾炎标准，可应用肾上腺糖皮质激素、血液滤过或者其他免疫抑制剂治疗。

桂枝茯苓丸是中医活血化瘀的第一方，始载于《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治第二十》，因该方能下死胎，又称催生汤、夺命丹。桂枝茯苓丸原方配比是以桂枝、茯苓、牡丹、桃仁、芍药各等分炼蜜为丸，是以妇人内有癥痼、又受孕成胎之血症，不易猛攻而和缓图治之法。

临床观察桂枝茯苓丸方证相应患儿，辨证可见患儿多属于桂枝体质。黄煌教授的《张仲景50味药证》［44］中将儿童桂枝体质归纳总结为：“平素体质偏弱；体型中等略瘦；肤白湿润细腻而无泽；下眼睑色暗；多汗，手足易凉；易出现腹壁拘急疼痛；舌质淡嫩有紫气，质地柔嫩而润泽，脉搏偏浮，中取则少力”。本研究临床观察发现，儿童桂枝体质能够采集到的主要辨证要点是形体适中偏瘦，肤白细腻少华，舌体质地柔软，舌色淡暗润泽，苔薄白脉浮缓。故而临床诊治儿童HSP只要符合这个辨证要点的，就可以选择桂枝茯苓丸处方或者开具中成药桂枝茯苓胶囊，因能切中病机，常收效甚捷。

本研究基于生物信息学对GSE80401基因表达谱进行分析及处理，结果表明，HSP的发生可能与对无机物的反应、凋亡信号通路、细胞外刺激的反应、炎性因子等相关，这些靶点可能是干预HSP的重要因素。Coremine Medical数据库预测中药组方也证明了桂枝茯苓丸具有良好的活血化瘀功效，主要通过调控炎症因子表达、调节机体免疫来治疗儿童HSP。HSPhsa-miR-3945及其Hub基因可能在表达水平上存在负相关关系，因目前样本有限，数据单一，需进一步的试验研究验证当前结论。Li等［45］发现，miRNA的改变可能参与了HSP的发病机制，可能成为HSP的治疗靶点或诊断标志物，但目前尚无更多文献报道，仍需进一步深入研究。中药复方是一个多成分的复杂体系，本研究仅从微观角度佐证了桂枝茯苓丸治疗儿童HSP的的作用机制，后续研究可在此研究的基础上加以临床和试验验证，使其对临床应用更具有指导意义。