陈平，张利娟 综述，李娜 审校

嘉铭（固安）生物科技有限公司，河北 廊坊 065504

20 世纪80 年代发展起来的一种新型疾病治疗方式——基因治疗，是以改变或纠正人的遗传物质为基础，将人正常或有治疗作用的基因通过相应的载体导入人体靶细胞，以发挥纠正或补偿有缺陷基因的作用，从而达到治疗相应疾病的目的。病毒载体是基因治疗中最常采用的工具之一。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体因其转染效率高［1］，安全性高［2］，已成为目前基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一，特别是在2012 年，由荷兰生物技术公司Uniqure 研发的第一个针对脂蛋白脂肪酶缺乏症（lipoprotein lipase deficiency，LPLD）的基因药物Glybera 通过欧盟认证，并获得欧洲首个被推荐上市的基因治疗药物以来，AAV 载体作为基因治疗的载体引起了越来越多研究者的关注。本文就AAV 的发现与生物学特性、重组AAV（rAAV）载体的设计、AAV 在临床基因治疗中的应用及其可能引发的不良反应作一综述，并对目前该病毒载体存在的问题及今后的研究方向进行展望。

1 AAV 的发现与生物学特性

AAV 最初是以一种污染成分被发现的，目前已分离到13 种血清型：AAV1 ～AAV13。这13 种血清型在系统进化树中的相似性和差异性见图1。此外，这些血清型的AAV 在衣壳氨基酸序列水平上也有很大差异，见表1。

表1 血清型AAV1 ～AAV13 衣壳同源性比较（%）Tab.1 Homology of capsids of AAV serotypes 1 to 13（%）

图1 AAV 系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of AAV

AAV 隶属于细小病毒科依赖病毒属，是一类微小、无被膜的线性单链DNA 病毒［3］。其基因组大小约4 700 bp，直径20 ～26 nm。AAV 为一种缺陷型病毒，需要辅助病毒（腺病毒辅助功能基因包括E1a、E1b、E2a、E4orf6 和VA RNA，疱疹病毒辅助功能基因UL5、UL8、UL22、UL9 及调节蛋白ICP0、ICP4、ICP22［4］）等的存在，才能感染宿主细胞，产生新的病毒颗粒，无辅助病毒存在时，野生型AAV 只能整合到19 号染色体长臂上，形成潜伏感染，随宿主细胞染色体复制而复制［3］。

AAV 基因组主要由反向重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）和2 个ITR 之间的2 个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成，左侧ORF 编码Rep78、Rep68、Rep52 和Rep40，右侧ORF 编码3 个衣壳蛋白VP1（相对分子质量87 000）、VP2（相对分子质量72 000）、VP3（相对分子质量62 000）［3］。AAV 衣壳由60 个衣壳蛋白构成，排列成T = 1 的二十面体结构［5］。

2 rAAV 载体

rAAV 载体通常是将野生型AAV（Wt-AAV）中的rep 和cap 基因被用于研究的目的基因所取代，只保留AAV 基因组两端的2 个ITRs。rAAV 载体作为目前最受欢迎的载体，相较于其他病毒载体的优缺点见表2。

表2 不同病毒载体系统的比较Tab.2 Comparison of different viral vector systems

2.1 rAAV 载体的设计

目前关于rAAV 载体的设计主要集中在两方面：一方面是关于rAAV 衣壳改造设计，另一方面是rAAV 载体构建的设计。

2.1.1 rAAV 衣壳的改造设计

自rAAVs 显示出良好的临床应用前景以来，人们试图通过设计新型rAAV 衣壳来获得其新的特性。衣壳改造的方法主要包括：自然发现、合理设计、定向改造和计算机生物信息学。

2.1.1.1 自然发现 如前所述，AAV 最初是作为一种细胞培养污染物被发现的，AAV2 是应用最为广泛的血清型。相关文献报道，最具临床前景的载体血清型是从自然界中分离出来的［6］。该观点主要体现在从人的肝脏组织中分离出来的AAV9 上，AAV9是F 血清型分支，具有绕过血脑屏障（blood brain barrier，BBB）转导至中枢神经系统（central nervous system，CNS）的能力。如最近备受关注的人类衍生的F 衣壳分支是从CD34+人类外周血造血干细胞中分离出来的，显示出无核酸酶基因编辑的能力［7］。

2.1.1.2 合理设计 改造载体衣壳的主要途径是合理设计，这种策略始于多肽（与细胞特异性受体结合的多肽序列）序列的简单拼接［8］。其他方法是将多肽序列融合至VP2 的氨基末端［9］，如单链可变片段［10］和设计的锚蛋白重复序列［11］，对细胞表面进行标记类似于抗体识别。此外，普遍认为3 倍突起在衣壳的靶向性和免疫原性方面起重要作用，因此，3 倍突起的暴露位置是多肽插入（增强受体结合）的理想位置。该方法不仅可重新定向衣壳，而且具有抑制免疫反应的能力。虽然对衣壳结构进行合理的改造可改善其靶向性，但也会对衣壳的稳定性等其他特性产生负面影响。而点击化学的引入可对病毒粒子组装后的衣壳进行修饰，通过点击化学氨基酸的方法可使寡核苷酸位点特异性地偶联到AAV 衣壳表面，从而有效地保护AAV 颗粒不受中和抗体的吞噬［12］。

2.1.1.3 定向改造 合理设计方法的局限性是对AAV 细胞表面结合、内化、转运、脱壳和基因表达的认识不足。新方法即定向改造更有优势。定向改造的基础在于对自然进化的模拟，衣壳在自然选择压力下产生具有特定生物学特性的遗传变异（如组织特异性、免疫逃逸和转基因表达）［6］。衣壳文库的定向进化不需要事先了解改造过程中所涉及的分子机制［13］。如通过3 倍突起处嵌入多肽序列文库进行反复的体外筛选，获得了具有显著重定向取向的衣壳［14］。许多研究也利用该方法从已存在的主要血清型序列中随机产生了嵌合衣壳（衣壳重组）［16］。值得注意的是最近开发的rAAV 载体，其可优先靶向HIV-1 感染的H9 T 细胞系［16］。其中较显著的定向改造方法是基于Cre 重组的改造［14］。该方法采用在3 倍突起的位置插入随机多肽片段，依靠Cre 重组酶来修复设计到载体基因组中的反向聚腺苷酸序列。利用该方法进化出的衣壳突变体能够绕过血脑屏障高效转导至中枢神经系统［17］。

2.1.1.4 计算机生物信息学 使用计算机工具大大提高了载体的设计方法，该方法不需要完全理解AAV 衣壳的生物学特性。近年来，运用计算机生物信息学改造新型衣壳的方法受到广泛关注。利用该技术发现了载体Anc80L65，在小鼠肝脏、骨骼肌、视网膜和耳蜗中具有很好的转导疗效［18］。最新的研究表明，人工合成的AAV2.7m8 载体感染外耳毛细胞的效率高于Anc80L65［19］。

2.1.2 rAAV 载体构建的设计

典型的rAAV 载体的设计通常均携带1 个基因表达盒，其中包括1 个启动子、1 个转基因和1个转录终止信号。一旦载体被传递到靶细胞核，这些成分就相互作用表达具有治疗水平的基因产物。基因表达盒的设计应满足治疗基因的要求（如转基因表达水平，包装容量）。在设计rAAV 载体时，应考虑衣壳与基因组之间的协同作用，最终需设计出一种衣壳和载体基因组的最优组合，以达到成功治疗人类疾病的目的。

2.1.2.1 调控转基因表达水平和特异性 rAAV 基因治疗平台通常利用1 个强启动子来实现转基因的高表达，其中包括巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子和CB7 启动子［20］，以及其他一些可增强基因表达的调控元件，如内含子［21］和土拨鼠肝炎转录后调控元件（woodchuck hepatitis post-transcriptional regulation element，WPRE）［22］。在人类细胞中，为了产生稳定的蛋白表达，密码子优化技术被广泛应用于rAAV 基因治疗，旨在提高rAAV 基因的表达水平［23-24］。在翻译水平上，Kozak 序列可进一步增加蛋白表达［23］。但蛋白质或RNA 分子的过表达可能对细胞的生长产生一定的毒性，如由强U6 启动子驱动的shRNA 与内源性microRNA（miRNA）的过表达导致小鼠死亡，可通过使用较弱的H1 启动子来改善［25］。另外，基于PolⅡ启动子的人工micro-RNAs（amiRs）表达新平台为平衡蛋白的表达提供了一种更为通用的解决策略［26-27］。表达特异性是基因治疗的另一个重要方面。在异常组织或细胞中的基因表达可能导致细胞毒性或引发不必要的免疫反应。从rAAV 载体基因组设计的角度来看，更好地限制基因表达的方法包括使用组织或细胞特异性启动子［28］，以及在3′未翻译区域（UTR）整合miRNA结合位点，以达到调控转基因表达的目的［29］。

2.1.2.2 对较大转基因所采取的策略 与其他病毒载体相比，AAV 载体的局限性是其包装容量较小（5 000 bp 包括ITRs）。目前已研究出几种策略可转导较大的治疗基因。研究表明，采用AAV 双载体的方法（rAAV、反式剪接以及杂合［30-31］）可将AAV 的包装容量增加至10 000 bp，triple AAV 载体的设计可转导14 000 bp 的DNA［32］。且已通过实验证明，双AAV 载体系统向哺乳动物内茸毛细胞（inner hair cell，IHC）传递otoferlipn 大型转基因，可部分恢复听觉功能［22］。利用反式剪接和杂交的triple AAV 载体，在视网膜中表达了全长CDH23 和ALMS1［33］。杂交AAV 载体已成功用于移植大型治疗基因，包括ABCA4［34］、RPE65［35］、ABCA4［36］和dysferlin［37］，利用该策略相较于其他方法有更好的临床应用机会。除此之外，还有研究采用设计1 个缩短版的基因，来编码1 个被截短但有功能的蛋白质的策略。人类抗营养不良蛋白（duchenne muscular dystrophy，DMD）基因的整个编码序列为11 500 bp，远超过了rAAV 的包装极限。对DMD 蛋白的结构与功能进行分析，发现其可产生几种更小的形式，再用rAAV进行包装［38］。开发适合rAAV 传递的微基因可能需要深入了解蛋白质的结构和功能，具有基因特异性。针对DMD 的微基因疗法仍在进行广泛的临床评估［38］。

2.1.2.3 延长转基因表达所采取的策略 尽管rAAV是基因治疗的理想载体，但其主要以非复制型游离基因组形式存在。因此，转导的载体基因组在有丝分裂细胞中逐渐丢失。近年来，一直在寻找复制细胞中保留转基因表达的方法。延长复制型细胞中转基因表达最直接的方法是促进rAAV 基因组整合。rAAV 基因组被发现以低频率整合［12］。这种罕见的整合事件通常导致部分基因组整合，因此不适用于基因治疗。基因编辑可通过针对性地对基因组进行整合来增强其持久性。一旦可编程核酸酶在靶基因组位点中引入DNA 断裂，宿主细胞的同源性定向修复（homology-directed repair，HDR）功能即可利用rAAV 基因组作为供体模板，将治疗性基因盒精确地插入宿主基因组中［39］。此外，无核酸酶的同源重组定向整合作为基因编辑的替代方法最近也受到广泛关注［6，40］。通过这种方式，无需通过核酸酶引入DNA 断裂即可实现序列的稳定整合。另外，还有研究将支架／ 基质附着区（S ／ MAR）序列插入到构建体中，使游离形式的AAV 在转导细胞中复制，从而延长载体存在的持久性［41］。

2.2 rAAV 载体的转染与包装 rAAV 载体设计成功后，需通过转染进入宿主细胞进行复制。传统的转染方法采用双质粒共转染：将一种含有rAAV 载体及一种含有rep ／ cap 基因的质粒共转染HEK293、A549 或HeLa 细胞，再感染辅助病毒［42］。由于该方法会有辅助病毒的污染，目前通常采用3 质粒共转染法：1 个含有包装信号和目的基因的病毒载体质粒、1 个含有腺病毒辅助基因形成的辅助质粒及由结构基因cap 和非结构基因rep 组成的质粒，将这3 个质粒共转染稳定表达E1a、E1b 辅助病毒基因的包装细胞系HEK293，就即可产生具有感染活性的rAAV。

在rAAV 的包装过程中，多采用多质粒共转染法，最常用的宿主细胞是HEK293 细胞［22，33，43］。细胞基因组内不含E1a 和E1b 的HeLa 细胞及A549细胞是制备高稳定和高生产率常用的细胞系，主要缺点是有辅助病毒污染。幼地鼠肾细胞（BHK）也可被用于生产rAAV 的宿主细胞，但由于该细胞是非人源性细胞的特性，限制了其应用范围，目前仅应用于HSV 杂合病毒的生产［44］。草地贪夜蛾（SF9）细胞用于rAAV 的生产是近年的研究热点［45］，目前最大的生产系统是利用SF9 作为宿主细胞的rAAV 生产系统。

2.3 rAAV 载体的纯化 rAAV 的分离纯化方法主要包括梯度离心和色谱技术。rAAV 的梯度离心纯化较常用的是氯化铯（CsCl）密度梯度离心法［33］和碘克沙醇［22］。色谱技术包括亲和色谱层析、离子交换色谱。亲和色谱基于rAAV 衣壳与色谱基质上耦合特异的生物配体或受体进行可逆作用，将病毒颗粒与杂蛋白、DNA 分离，优点是结合容量大、分辨率高、回收率高，缺点是特异性强，不适用于每一种血清型rAAV［42］。为了解决此问题，相关研究人员利用DNA 重组技术对病毒衣壳蛋白进行修饰，再利用亲和层析进行分离纯化。亲和色谱层析不能区分空心病毒颗粒和实心rAAV 载体，空心病毒在包装单链DNA 后等电点降低，可通过高分辨率的离子交换方法与rAAV 载体分离［46］。

3 rAAV 载体在临床基因治疗中的应用

自1983 年首次开发rAAV 载体以来，在基因治疗方面已取得了很大进展，主要体现在两方面：rAAV载体种类（新型载体的发现和现有载体的改造）和临床治疗疾病种类扩展（由遗传性疾病到基因缺陷病）。首先，AAV 的载体类型由单一的rAAV2 扩展到rAAV1、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9等，并出现了一批有显著治疗效果的AAV 载体；其次，在临床实验上，治疗疾病的种类有很大发展，从最初的针对于单基因遗传病［如肺囊性纤维化（cystic pulmonary fibrosis，CPF）和血友病B 等］，发展到眼部疾病、关节炎、肿瘤、肌营养不良症、神经性疾病以及血液性疾病等一系列基因缺陷病，见表3。

表3 AAV 载体基因治疗药物的临床试验Tab.3 Clinical trials of adenoviral vectors as drugs for gene therapy

3.1 眼部方面的疾病 对于眼部疾病早先是利用腺病毒载体进行治疗，如PING 等［47］利用高容量的腺病毒载体治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）。近年来，由于rAAV 载体的优势，出现了多项以rAAV 为基因治疗载体治疗视网膜色素变性、莱伯氏先天性黑蒙以及缺血性视网膜疾病的临床试验。其中，rAAV 介导的RPE65基因治疗莱伯氏先天性黑蒙于2018 年1 月获得FDA 批准。这是美国第一个针对单一基因突变疾病的临床基因治疗药物。在临床研究上发现，由rAAV介导的基因治疗药物未引起严重的免疫反应，也未出现明显的毒副作用，并对患者的视力恢复起到了一定的作用［48］。这些研究表明，rAAV 载体是基因治疗中最有前景的基因转移载体，目前国内外关于rAAV 应用于眼部治疗的研究已在多方面开展，相信经过进一步的深入研究，利用rAAV 进行眼部治疗将会有更多的突破。

3.2 听觉神经系统方面的疾病 在听觉神经系统的基因治疗研究中，较常用的AAV 载体包括AAV2、AAV1、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、Anc80L65［49-52］。虽然在人类内耳基因治疗中尚无临床实验数据，但临床前动物研究已表明，以rAAV 作为基因治疗载体是有效的。如SUZUKI 等［52］的一项研究表明，利用Anc80L65 载体可提高毛细胞存活率，有效恢复耳蜗听觉皮层神经反应和前庭刺激行为反应。截至目前，仅有一项正在进行的人类临床实验旨在研究人类内耳细胞中rAAV 的病毒转导效率［53］（https：／ ／clinicaltrials.gov ／ ct2 ／ show ／ NCT03996824）。

rAAV 介导的基因药物除了用于治疗上述疾病外，还应用于其他多种基因缺陷性疾病的治疗，包括血液系统疾病（血友病）、肿瘤、皮肤与肌肉系统疾病（肌营养不良症）、关节炎、糖尿病等。

4 AAV 可能引起的不良反应

AAV 在进行动物和人类临床实验时，可能会引起不良反应。首先是免疫反应，当rAAV 感染抗原呈递细胞时，由于Toll 样受体9（Toll like receptor 9，TLR9）的激活，可引起温和的先天免疫反应，TLR9识别核酸中未甲基化的CpG，从而激活经典通路和非经典NF-κB 通路，促使炎细胞因子和干扰素应答基因的表达。这些基因的表达反过来会产生CTL反应和稳定的中和抗体效价［4］。为避免AAV 介导的基因转移所引起的免疫反应，目前常用的方法有以下两种：①用免疫抑制药物，以避免CTL 反应，这在人类因子Ⅸ试验中取获得了成功［54］；②在设计rAAV 载体时，加入TLR9 抑制的DNA 序列，如将来自人类端粒的TTAGGG 的多拷贝整合至rAAV 基因组中，以逃避先天免疫反应［1］。

第2 种不良反应是可能会引起插入诱变和诱导癌症。NGUYEN 等［55］利用AAV 基因疗法治疗狗的血友病A 时发现，AAV 携带的治疗性基因片段（FⅧ）已整合至狗肝脏细胞的基因组，有些甚至整合在影响细胞生长的基因附近，这些狗的某些肝脏细胞分裂得比其他细胞更快，并形成子细胞团块。因此，他们怀疑这些基因插入物激活了生长相关基因，使得这些肝脏细胞更为快速地分裂。这一发现证实了AAV 基因疗法会将基因片段整合至宿主细胞染色体上，虽然整合频率不高，但仍有潜在致癌性，可能诱发癌症。

第3 种不良反应是静脉高剂量注射AAV 会产生严重毒性。HINDERER 等［56］研究发现，高剂量AAV 注射后，在恒河猴和仔猪中均引起了严重的毒性。3 只恒河猴出现明显的转氨酶升高。2 只转氨酶升高后消退，无临床后遗症，而有1 只发生急性肝衰竭和休克。

5 展 望

虽然rAAV 载体在人类基因治疗过程中取得了一些成果，但rAAV 最终应用于临床治疗尚有一些亟待解决的问题。首先，目前rAAV 载体存在两个缺陷：载体容量小和辅助基因污染，针对这些问题，若能开发出大容量，且能用于扩大生产和应用于临床的rAAV 载体，筛选出包装rAAV 所需的所有辅助基因均由包装的细胞来提供的细胞系，可避免辅助基因的污染；其次，随着AAV 血清型的多样性和新型AAV 载体的不断开发，将带来其安全性问题；最后，rAAV 的大规模生产、纯化能否达到临床治疗所需的剂量也是将来载体应用中需要考虑的问题。相信后续随着rAAV 载体研究的不断深入，作为基因治疗最常用的载体之一，其应用前景将更加广阔。