卓晓琴，褚冰洁，姜珊，强鹏侠，傅元欣，冯潇，雒丽红，冯德杰

兰州生物制品研究所有限责任公司质量检定室甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046

药用辅料指制剂中除活性成分外其他成分的总称，是药物制剂的基础材料，具有赋形、稳定、改善依从性等作用［1］。药用辅料可影响药物的安全性、有效性和经济价值，乳糖作为药用辅料的一种，常用作生物制品的赋形保护剂，尤其在成品冻干疫苗的生产过程中，对保证产品的外观和稳定性起着重要的作用［2］，其纯度对疫苗质量具有重要影响。因此，有必要对冻干疫苗中乳糖含量进行严格控制，使其在安全的使用范围内［3-4］。

《中国药典》四部（2015 版）［5］提出采用高效液相色谱法检测原辅料乳糖含量，方法为单点校正法，此方法不仅系统误差较大，且使用的示差检测器受环境温度影响明显，易引起基线不稳、灵敏度低和色谱柱耐用性差等问题［6］；同时，《中国药典》三部（2020 版）仅对A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗中的主要活性成分多糖进行质量控制，均未要求测定疫苗中的乳糖含量，因此检定规程中尚无乳糖含量检测方法。随着以乳糖作为赋形保护剂的多糖类疫苗种类不断增加，疫苗中赋形保护剂的含量逐渐成为评价疫苗质量的重要指标，因此，建立原辅料乳糖和多糖疫苗乳糖含量的通用检测方法尤为重要［7］。

本研究采用离子色谱法，选择外标定量法，检测原辅料乳糖、A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗及ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗中的乳糖含量，并对方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 多糖结合物原液 A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液：A 群（批号：B-20200603）、C 群（批号：B-20200603）脑膜炎球菌多糖原液，由本公司菌苗一室制备；ACYW135 群脑膜炎球菌多糖结合物原液（批号：B-20200603）由本公司第一研究室制备。

1.2 辅料乳糖及疫苗 原辅料乳糖（批号：20190202、20190306、20190307）购自湖南尔康制药股份有限公司；A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗（批号：2020-07100、202007101、202007102）由本公司提供；ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗（批号：201909004、202002001、202002002）由本公司第一研究室提供。

1.3 主要试剂及仪器 乳糖标准品（批号：100058-201605）和蔗糖标准品（批号：111507-201704）购自中国食品药品检定研究院；高纯氮气购自兰州新永芳工贸有限公司；Milli-Q 超纯水制备仪购自美国Millipore 公司；0.2 μm 滤膜购自德国Merck 公司；3 K 超滤离心管购自美国PALL 公司；氢氧化钠（50% w ／ w）、ICS-3000 型离子色谱、CarboPac PA20分析柱（3 mm × 150 mm）和CarboPac PA20 保护柱（3 mm × 30 mm）购自美国Thermo Fisher 公司。

1.4 对照品溶液配制

1.4.1 乳糖对照品溶液（10 mg ／ L） 取乳糖标准品0.25 g 于250 mL 容量瓶中，混匀后取1 mL 至100 mL容量瓶中，用纯化水稀释定容至刻度，混匀备用。

1.4.2 蔗糖对照品溶液（10 mg ／ L） 取蔗糖标准品0.25 g 于250 mL 容量瓶中，混匀后取1 mL 至100 mL 容量瓶中，用纯化水稀释定容至刻度，混匀备用。

1.4.3 乳糖蔗糖混合对照品溶液（5 mg ／ L） 将乳糖对照品溶液（10 mg ／ L）和蔗糖对照品溶液（10 mg ／ L）按1 ∶1 混匀备用。

1.5 校正曲线系列测试液配制 用纯化水将乳糖对照品溶液（10 mg ／ L）稀释，制备质量浓度分别为2、4、6、8、10 mg ／ L 的校正曲线系列测试液。

1.6 供试品处理 成品疫苗每批各取1 支，每支加纯化水溶解后移至100 mL 容量瓶中定容至刻度，混匀后取1 mL 至10 mL 容量瓶定容至刻度，取5 mL于3 K 超滤离心管中，4 ℃，5 500 × g 离心60 min，滤出液经0.2 μm 滤膜过滤，混匀备用。

1.7 加标供试品溶液配制

1.7.1 原辅料乳糖加标供试品溶液 用纯化水将原辅料乳糖（批号：20190306）和乳糖对照品溶液（10 mg ／ L）稀释，制备质量浓度分别为3、6、9 mg ／ L的原辅料乳糖加标供试品溶液，每个浓度制备3 份平行样品。

1.7.2 A 群C 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品溶液 取A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液，模拟成品配制比例，制备质量浓度分别为3、6、9 mg ／ L 的A 群C 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品溶液，每个浓度制备3 份平行样品，按1.6 项进行离心及过滤处理。

1.7.3 ACYW135 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品溶液 取ACYW135 群脑膜炎球菌多糖结合物原液，模拟成品配制比例，分别加入乳糖对照品溶液（10 mg ／ L），制备质量浓度分别为3、6、9 mg ／ L的ACYW135 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品溶液，每个浓度制备3 份平行样品，按1.6 项进行离心及过滤处理。

1.8 供试品溶液配制

1.8.1 原辅料乳糖 取原辅料乳糖（批号：20190306）0.04 g 于50 mL 容量瓶中，混匀后取1 mL 至100 mL容量瓶中，用纯化水稀释定容至刻度，经0.2 μm 滤膜过滤，备用。

1.8.2 A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗 取A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗（批号：202007100），按1.6 项方法处理。

1.8.3 ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗 取ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗（批号：202002001），按1.6 项方法处理。

1.9 淋洗液制备 取990 mL 纯化水，超声处理15 min后加至淋洗液瓶，取10.4 mL 氢氧化钠（50% w ／ w）溶液加至淋洗液瓶，加入氮气保护，混匀，即为200 mmol ／ L 氢氧化钠淋洗液。可利用仪器自动淋洗液在线发生器功能，产生实际所需浓度的氢氧化钠淋洗液。

1.10 离子色谱法的建立 色谱条件：色谱柱为CarboPac PA20 分析柱（3 mm × 150 mm）和CarboPac PA20 保护柱（3 mm × 30 mm），淋洗液为30 mmol ／ L氢氧化钠溶液，流速0.5 mL ／ min，柱温30 ℃，进样体积25 μL。用淋洗液平衡系统至基线平稳后，上样，收集色谱图。

1.11 方法的验证

1.11.1 系统适用性 按1.10 项色谱条件平衡系统，分别取乳糖对照品溶液、蔗糖对照品溶液和乳糖蔗糖混合对照品溶液，经0.2 μm 滤膜过滤，待基线平稳后上样，收集色谱图，以乳糖峰为主，记录其理论塔板数及拖尾因子，并记录乳糖及蔗糖的分离度。

1.11.2 专属性 分别取流动相空白、乳糖对照品溶液（10 mg ／ L）、A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液、ACYW135 群脑膜炎球菌多糖结合物原液、A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液加乳糖和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖结合物原液加乳糖上样，确定乳糖保留时间。

1.11.3 准确度 分别取1.7 项制备的原辅料乳糖、A 群C 群脑膜炎球菌多糖原液和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖原液的乳糖加标供试品溶液，依次上样测定，计算回收率。

1.11.4 精密度 取1.8 项制备的原辅料乳糖、A群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗的供试品溶液各1 批，每批样品制备6 份平行供试品溶液，连续上样测定，计算平行检测结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察重复性。在同一日期由不同实验人员（A 和B）分别制备供试品溶液，使用同一仪器测定，计算不同实验人员检测结果的RSD，考察中间精密度。

1.11.5 检测限和定量限 逐级稀释1.4.1 项下乳糖对照品溶液（10 mg ／ L），按1.10 项色谱条件进行测定，以信噪比（S ／ N）为3 ∶1 确定检测限，以信噪比（S ／ N）为10 ∶1 确定定量限。

1.11.6 线性和线性范围 取校正曲线系列测试液，按1.10 项色谱条件进行测定，连续重复上样6次，以此浓度为横坐标，乳糖峰面积为纵坐标，用最小二乘法拟合成校正曲线，计算其r2值。

1.11.7 耐用性 通过调节流速和淋洗液比例，考察乳糖主峰与蔗糖峰之间的分离度及乳糖主峰的拖尾因子变化情况。

1.12 方法的初步应用 用建立的方法分别测定3个批次原辅料乳糖、A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗中的乳糖含量，每批制备3 份平行样品，计算RSD 值。

2 结 果

2.1 系统适用性 结果显示，乳糖和蔗糖保留时间分别为8.634、6.350 min；乳糖理论塔板数（N）为6 861，大于5 000，符合通常不低于5 000 的要求；拖尾因子（T）为1.28，在0.95 ～1.50 范围内；乳糖峰和蔗糖峰分离度（R）为3.6，大于1.5。表明该方法可将乳糖与蔗糖较好地分离。

2.2 专属性 结果显示，乳糖对照品溶液（10 mg／L）进样后，保留时间为8.884 min；而流动相空白、A群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液和ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合物原液均未在上述保留时间出现吸收峰；加入乳糖的A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合物原液和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖结合物原液分别在8.900 和8.917 min 出峰，与直接测定乳糖对照品溶液（10 mg ／ L）的tR相差小于0.033 min。见图1。表明该方法对乳糖测定具有较好的特异性。

图1 方法的专属性验证Fig.1 Verification for specificity of developed method

2.3 准确度 结果显示，3 个浓度的原辅料乳糖加标供试品回收率为98.6% ~ 100.2%，平均值为99.6%；3 个浓度的A 群C 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品回收率为95.2%~97.1%，平均值为96.1%；3 个浓度的ACYW135 群脑膜炎球菌多糖原液乳糖加标供试品回收率为93.9% ~ 96.6%，平均值为94.9%，均符合《中国药典》四部（2020 版）规定。见表1。表明该方法对原辅料乳糖及成品疫苗中乳糖含量测定均具有较好的准确度。

表1 方法的准确度验证Tab.1 Verification for accuracy of developed method

2.4 重复性及中间精密度 结果表明，同批次同浓度待检样品连续测定6 次后，对于原辅料乳糖，2 名实验人员检测结果的RSD 均为0.5%；对于A 群C群脑膜炎球菌多糖疫苗，2 名实验人员检测结果的RSD 均为0.4%；对于ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗，2 名实验人员检测结果的RSD 分别为1.0%和0.4%，均小于2%。见表2。表明该方法在检测原辅料乳糖及成品疫苗乳糖含量时，均具有较好的重复性。

表2 方法的重复性验证Tab.2 Verification for reproducibility of developed method

2 名实验人员连续测定6 次同批次同浓度待检样品后，原辅料乳糖、A 群C 群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135 群脑膜炎球菌多糖疫苗检测结果的RSD 分别为0.6%、0.5%和0.9%，均小于1.0%。见表3。表明该方法在检测原辅料乳糖及成品疫苗乳糖含量时，均具有较好的中间精密度。

表3 方法的中间精密度验证Tab.3 Verification for intermediate precision of developed method

2.5 检测限及定量限 结果显示，该方法的最低检测限及定量限分别为0.001 mg ／ L 和0.05 mg ／ L。

2.6 线性及线性范围 结果显示，乳糖浓度在2 ～10 mg ／ L 范围内与峰面积具有良好的线性关系，6次校正曲线的r2值均大于0.999。见表4。表明该方法线性关系较好，能够满足检测要求。

表4 方法的线性和线性范围验证Tab.4 Verification for linearity and linear range of developed method

2.7 耐用性 结果显示，在分别改变淋洗液浓度和流速的条件下，乳糖主峰与蔗糖峰的保留时间有所变化，但两种糖的分离度均大于1.5。见表5。表明该方法具有良好的耐用性。

表5 方法的耐用性验证Tab.5 Verification for durability of developed method

2.8 方法的初步应用 结果显示，每批样品连续测定3 次，RSD 均小于1.0%。见表6。表明该方法在实际应用中具有良好的重复性。

表6 方法的初步应用Tab.6 Preliminary application of developed method

3 讨 论

离子色谱法是用于分析阴离子和阳离子的色谱技术，是液相色谱的一个重要分支，在现代分析领域如食品卫生、环境安全、化学工程、生物工程等方面均具有非常广泛的应用［8］。近年越来越多的研究报道称离子色谱法可有效分离单糖、双糖和低聚糖并准确测定其含量，现已成功应用于糖类化合物的分析［9-10］。

离子色谱法与高效液相色谱法及传统化学法比较具有以下优势：①灵敏度更高。离子色谱法检测浓度达ppm 级别，相比高效液相色谱法提高了3个数量级；②耐用性强。在改变流速和淋洗液浓度后，仍有较好的分离度；③解决了化学法仅能测定总糖或还原糖，不能准确测定具体乳糖含量的问题［11］；④操作安全简单。化学法中经常会用到有毒试剂，如苦味酸（即2，4，6-三硝基苯酚，俗称黄色炸药）、苯酚、浓硫酸等，对人体危害极大［12-13］，在本方法中，样品前处理简单，避免采用剧烈的化学试剂预处理，进一步保障了实验人员的安全；⑤分析快速，降低成本。离子色谱所用的积分安培检测器克服了示差检测器系统平衡时间较长且对温度较敏感的缺点，短时间内可快速完成检测，并且分析柱在进样1 000次后乳糖理论塔板数仍在6 000 以上，明显降低了检测成本。

目前，离子色谱法已广泛应用于检测婴幼儿配方食品和乳制品中的糖类［14-15］，将样品进行简单稀释即可对单糖和二糖等低聚糖进行良好的定性和定量分析。基于以上优点，本研究采用离子色谱碳水化合物分析柱、氢氧化钠淋洗液等梯度洗脱系统、积分安培检测器，建立对原辅料乳糖和2 种多糖疫苗乳糖含量的测定方法，结果显示，该方法专属性较强，乳糖能够与样品中的杂质峰和溶剂峰完全分离，后者未对目标物的测定产生影响；具有较好的准确度、重复性及中间精密度，RSD 均小于1.0%；标准曲线的r2均大于0.999，乳糖浓度在2 ～10 mg ／ L范围内与峰面积具有良好的线性关系。同时该方法在实验条件改变的情况下仍有一定耐受性，且在实际应用中表现出良好的重复性。

综上所述，本研究建立的方法准确可靠，易于操作，可通用于原辅料乳糖和文中两种多糖疫苗中乳糖含量的检测方法，也为其他以乳糖作为赋形保护剂的疫苗乳糖含量的检测提供了实验依据。