吉士东， 王 丽， 胡启国， 杨爱梅

(1.南阳师范学院生命科学与农业工程学院， 河南 南阳 473061；2.商丘市农林科学院， 河南 商丘 476000)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]隶属于旋花科甘薯属，是世界上重要的粮食、饲料和工业原料用作物之一[1]。遗传上甘薯有高度杂合、种间与种内杂交不亲和以及遗传资源缺乏等特点[2]，因此其遗传基础比较狭窄，病毒病、病虫害危害也较为严重，制约了甘薯品种在遗传方面的改良。目前世界上分布着甘薯属600～700个物种[1,3-4]，甘薯近缘野生资源非常丰富。甘薯近缘野生种具有抗逆、抗虫、抗病等优良基因[2,5]，与甘薯遗传性状的差别较大，因此利用甘薯近缘野生种与甘薯品种进行杂交，为扩大甘薯基因库及改良甘薯遗传性状等方面提供了重大的基因资源来源。将甘薯近缘野生种与甘薯品种进行杂交时，常要求它们的染色体组一定相同或大致相同。张必泰等[6]指出，甘薯属植物的染色体基数虽然都是15，但不同种的染色体组却不相同。根据它们杂交是否亲和，可以把甘薯近缘野生种植物分成两大类群，即A群和B群[7]。A群品种有Ipomoea.lacunosa、Ipomoea.triloba、Ipomoea.gracilis等，B群品种有Ipomoea.leucantha、Ipomoea.littoralis、Ipomoea.batatas和Ipomoea.trifida及其系列种等。A群可以自交结实，相互杂交容易成功；B群能够杂交，自交不结；A群与B群各种之间杂交并不亲和。

I.trifida中文名为三浅裂野牵牛，有2倍体、3倍体、4倍体和6倍体[8]。I.trifida被认为是甘薯的野生祖先[9-12]。I.trifida具有优良的特性，如高淀粉、抗病虫、耐病毒、抗旱等，可以通过利用甘薯栽培种与I.trifida群体进行杂交，将其优异性状基因导入甘薯栽培种中，来提高甘薯品种的淀粉含量以及甘薯对病虫害和环境的抗性。甘薯近缘种有不同倍数的染色体，但由于它们的细胞质比较浓厚、染色体极小且数目多、着色能力又较弱、不易观察，较难得到分裂相多、分散度高的制片[13]。目前对甘薯近缘野生种体细胞染色体形态、倍数分析等研究很少，相关的细胞遗传学研究也相对薄弱，这对研究甘薯及近缘野生种的起源、分类以及进化有着直接影响。因此，很有必要加强对甘薯野生种材料进行染色体观察和细胞学的研究鉴定。

秋水仙素是一种生物碱。自1937年美国学者布莱克斯利等用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙碱就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种中[14]；对二氯苯是一种有机化合物，用于有机合成，它是一种优良的预处理药物，在染色体制片技术中，基本上可以达到秋水仙素或其他药物的效果[15]；8-羟基喹啉(8-HQ)是一种应用范围比较广的杀菌剂，能够与金属离子结合，通过夺走细胞内的铜离子和铁离子起到抗菌作用，可用来对甘薯根尖细胞进行预处理[16]。

在甘薯细胞染色体研究中，选择合适的预处理剂、处理浓度及时间是获得染色体分散均匀的中期分裂相的关键。本实验采用0.1%秋水仙素、对二氯苯饱和溶液、2 mmol/L 8-HQ三种试剂对甘薯野生种I.trifida根尖进行预处理，确定最佳预处理方法。采用最佳预处理方法明确秋水仙素加倍后的I.trifida和甘薯品种徐薯18的倍性，为其远缘杂交育种以及杂种细胞遗传学行为的进一步研究提供必要的细胞学依据，并为甘薯属植物的染色体实验方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘薯近缘野生种I.trifida、甘薯品种徐薯18由徐州甘薯研究中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1根尖材料预处理与制片

剪取温室盆栽I.trifida、秋水仙素处理加倍后的I.trifida、徐薯18枝条进行水培，待其发根长至1～1.5 cm，于08：00—10：00时取样。将I.trifida根尖分别用0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ在4 ℃冰箱分别进行1、2、3、4、5 h的预处理，用对二氯苯饱和溶液在室温下分别进行1、2、3、4、5 h的预处理，每种预处理液均设置清水处理的根尖作为对照。用卡诺氏溶液固定20～24 h，70%乙醇冲洗2次，转入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存备用。取固定后的根尖材料，蒸馏水漂洗2～3次，于60 ℃恒温水浴中用1 mol/L HCl解离8～10 min，用蒸馏水漂洗2～3次，蒸馏水中保存，0～1 h内制片。切取尖端1～2 mm，捣碎，用改良苯酚品红溶液染色5～10 min后，常规压片镜检，将具有完整细胞轮廓，且染色体分散良好的细胞用SPOT RTKE冷CCD进行采集图像。

1.2.2数据分析

在显微镜下观察，选取细胞均匀分散的区域，统计有丝分裂指数。

有丝分裂指数=(视野内观察到的分裂细胞数目/视野内观察到的总细胞数目)×100%。

1.2.3染色体倍性分析

采用最佳预处理方法对秋水仙素加倍后的I.trifida与甘薯品种徐薯18进行倍性鉴定。每种材料统计30个染色体分散良好的分裂相细胞，统计具有一致染色体数目的细胞，把85%以上细胞都具有的染色体数目定为该植物的染色体数目[17]。

2 结果分析

2.1 不同预处理方法对压片效果的影响

本试验中，使用0.1%秋水仙素、对二氯苯饱和溶液、8-HQ三种试剂分别处理1、2、3、4、5 h的甘薯近缘野生种I.trifida根尖染色体压片结果显示，3种预处理剂均可以使根尖细胞的有丝分裂停留在中期。但采用对二氯苯饱和液与2 mmol/L 8-HQ 溶液处理根尖后，染色体收缩程度适中，分散性良好，便于计数(见图1)，而用秋水仙素处理的材料中染色体较长，且分散性不理想。因此，在本试验中预处理剂选用对二氯苯饱和液与2 mmol/L 8-HQ溶液较好。

注：A为对二氯苯饱和溶液处理3 h；B为2 mmol/L 8-HQ处理2 h。图1 对二氯苯饱和溶液与2 mmol/L 8-HQ预处理的甘薯近缘种I. trifida根尖有丝分裂Fig.1 Root tip mitosis of I. trifida pretreated with saturated p-dichlorobenzene and 2 mmol/L 8-HQ

2.2 不同预处理方法对甘薯近缘种I.trifida根尖有丝分裂的影响

3种试剂在不同处理时间下对甘薯近缘种I.trifida根尖有丝分裂的影响统计结果见表1。实验结果表明，3种预处理剂的对照组细胞中均有少许分裂相，但有丝分裂指数较低。随着3种预处理剂处理时间的延长，有丝分裂指数均上升。其中0.1%秋水仙素处理 2 h 后的中期有丝分裂指数约是处理1 h 的1.18倍，是对照的2.68倍；对二氯苯饱和溶液处理3 h后的中期有丝分裂指数约是处理1 h的1.43倍，是对照的5.22倍；2 mmol/L 8-HQ处理2 h后的中期有丝分裂指数约是处理1 h的1.34倍，是对照的4.09倍。但随着时间的不断延长，3种预处理剂的有丝分裂指数均有不同程度的下降趋势，但均高于对照组。这说明不同预处理剂的处理时间很关键，更长的预处理时间可能会部分抑制甘薯近缘野生种根尖细胞的有丝分裂。

表1 3种试剂不同处理时间对甘薯近缘野生种I.trifida根尖有丝分裂的影响

2.3 染色体倍性鉴定

用对二氯苯饱和溶液对甘薯近缘野生种I.trifida、秋水仙素加倍后的I.trifid与甘薯品种徐薯18的根尖进行3 h预处理，采用相同的压片方法进行镜检。各材料染色体数目统计情况见表2，染色体形态见图2。由表2可知，I.trifida染色体数为30的占统计总数的90%，秋水仙素加倍的I.trifid染色体计数为60的占统计总数的86.7%，徐薯18染色体计数为90的占统计总数的86.7%。实验结果表明，甘薯近缘种I.trifida染色体数目以30条为主，秋水仙素加倍处理后的I.trifid染色体数目以60条为主，徐薯18染色体数目以90条为主。由于甘薯属植物染色体基数 x=15，因此本实验中甘薯近缘种I.trifida是二倍体(2 n=2 x=30)，秋水仙素加倍处理后的I.trifid是四倍体(2 n=4 x=60)，徐薯18是六倍体(2 n=6 x=90)。

表2 各材料不同数目染色体的细胞及比例

注：A为I.trifida；B为秋水仙素加倍后的I.trifid；C为徐薯18。图2 染色体倍性计数Fig.2 Chromosome number of the materials

3 讨 论

由于甘薯近缘种染色体比较小且数目多、着色能力弱、不易观察[13,16]，所以在对其进行染色体观察以及计数时，最好是在细胞分裂下进行，以有丝分裂中期的染色体最为合适。在细胞学上常利用秋水仙素、对二氯苯饱和溶液、8-HQ对活体细胞进行预处理来积累中期分裂细胞，便于染色体观察。每种植物的染色体大小及数目不同，所采用的预处理剂的浓度、时间及其效果也不同。有关预处理剂对不同材料进行根尖细胞有丝分裂的研究，在花生、辣椒、大蒜、洋葱、蚕豆等[18-22]植物中均有报道，而相关研究在甘薯属植物中报道较少。本研究比较不同的预处理方法对甘薯近缘种I.trifida积累中期分裂相的影响，得出最优的预处理方法，从而为甘薯近缘野生种及其他甘薯根尖细胞预处理提供了直接参考，达到减少实验步骤和避免材料浪费的目的。

本试验中，对二氯苯饱和液与2 mmol/L 8-HQ溶液压片效果较好，对二氯苯饱和溶液处理I.trifida根尖3 h时，细胞有丝分裂指数最高。其中2 mmol/L 8-HQ处理2 h时甘薯近缘野生种I.trifida细胞有丝分裂指数最高，这与王路等[16]研究结果一致。本研究发现，0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ和对二氯苯饱和水溶液3种预处理剂均随着处理时间的延长，I.trifida根尖有丝分裂指数均先增加后降低(见表1)，这与赛尔兰·热合买提等[23]研究结果相同。其原因可能是由于长时间的处理影响细胞内原有的代谢活力，改变了细胞内原有的物质平衡并阻止细胞内的分裂转化，相应延长了细胞周期，导致根尖生长缓慢[23-24]。本试验没有对不同预处理剂进行更小范围的处理时间研究，更小范围的处理时间对I.trifida细胞的有丝分裂的影响是否显著，还需进一步研究探讨。

I.trifida被公认为甘薯的近缘祖先，但I.trifida在分类学和甘薯进化中的地位还存在很大争议，因为该品种存在二倍体、四倍体和六倍体。因此有研究者认为，I.trifida本身就是一个包括从二倍体到六倍体的多倍体和多倍体间杂种的综合群体——复合体(species，complex)[9,25]。迄今为止，甘薯近缘种I.trifida只有六倍体成功应用于甘薯育种中。经本试验中最优处理方法鉴定供试材料甘薯近缘种I.trifida为二倍体。六倍体甘薯自交不亲和，由于杂交育种，导致甘薯遗传背景非常复杂。与六倍体甘薯相比，二倍体I.trifida遗传组成简单，遗传背景清晰。将遗传背景清晰的甘薯近缘种I.trifida作为亲本，和我国栽培甘薯品种进行杂交，既能将甘薯野生种质导入栽培甘薯品种中，又可以降低甘薯野生种质遗传干扰，从而能更加集中目标进行甘薯遗传研究。本试验中经秋水仙素处理加倍后的I.trifida经鉴定是四倍体。多倍体可以在远缘杂交中克服种间不育性，实现基因的种间转移[26]，具有更强的遗传可塑性[27]。对于得到的四倍体I.trifida是否能够直接利用，或作为中间亲本把其野生亲本的优良性状传递到栽培种中，还有待于进一步研究。

甘薯是一种遗传上很复杂、很不稳定并且十分难掌握的试验材料，虽然它的野生资源的种类十分丰富而且分布广泛，但人们所能收集到的甘薯野生资源还很少，所以关于甘薯属植物种的分类原则、进化关系在世界上至今仍然没有得到统一的认识。有关甘薯属植物细胞遗传学研究在我国仍然比较薄弱，而且国外有关这方面的文献也比较少。但随着生物技术的日益发展、甘薯育种要求越来越高以及野生资源的进一步引进、开发和利用，这些问题会变得越来越清楚。