刘正杰， 张 全， 林 春， 袁 程， 董玉梅， 何 丽

(1.云南农业大学农学与生物技术学院， 昆明 650201；2.云南农业大学特色小宗作物研究中心， 昆明 650201)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld.)为苋科藜属一年生常异花授粉的异源四倍体(2 n=4 x=36)双子叶植物，原产于南美洲安第斯山脉高海拔山区，是当地最重要的粮食作物，籽粒被南美洲人称为“粮食之母”[1]，富含与人体相近的赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和异亮氨酸等多种必需氨基酸、优质蛋白质、多种矿质元素、多种维生素和膳食纤维等营养成分，以及皂苷、黄酮、多酚等活性物质[2]。被国际粮农组织推荐为最适宜人类的“全营养食品”[3]，南美洲每年生产的藜麦75%主要出口美国和欧洲发达国家。随着人们生活水平的提高、保健意识的增强，对粮食的多样性、营养性、安全性、健康性要求大幅度提升，藜麦的需求量逐年大幅增加[4]。藜麦具有耐旱、耐盐碱、耐贫瘠、耐寒冷、耐霜冻等强的抗逆特性，在海拔4 000 m以下区域均可种植[4]，具有广泛的适应能力和应用潜力。近十年来，山西、青海、云南、陕西、甘肃、河北等省区通过引种，呈现规模化种植的趋势[5]。2019年，全国种植面积1.67 万hm2，总产量约2.88万t，约占世界总产量的15%，种植面积和总产量居世界第3位，位于南美洲的秘鲁和玻利维亚之后[6-7]。预计到2025年，国内对藜麦的需求量将达10 万t，然而目前国内藜麦种质优劣不一，优良种质资源缺乏，自繁种退化严重，品种选育及优良品种培育成为制约藜麦产业化发展的主要瓶颈[4]。因此，目前迫切需要加强优质藜麦种质的引进、筛选、培育及创新。丰富的种质资源是创制新品种的重要材料基础。甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)、叠氮化钠(NaN3)、秋水仙素(colchicine)、亚硝酸钠、60Co-射线、γ射线、激光、离子束及快中子等理化诱变处理是农作物种质创新与育种的有效途径[8]，同时也为基因及基因功能研究提供了重要材料。EMS是一种高效、稳定的化学诱变剂，主要用于基因突变、基因重组、碱基置换，其诱变的烷基化作用位点在鸟嘌呤N-7位置上，易产生高密度等位基因点突变[8]。诱变的效率和频率较高，范围较广，染色体畸变率较低[9]。与叠氮化物、碱基类似物等其他诱变剂相比，具有显性突变的特点，易于筛选到目标性状的突变体[10]。利用EMS对拟南芥[11]、水稻[12]、甘蓝型油菜[13]、谷子[14]、裸大麦[15]及与藜麦同属的甜菜[16]等植物进行诱变的研究较多，而用其诱导藜麦，开展突变体筛选和诱变育种的研究鲜见报道。本研究主要以白、红、黄和黑色四个品系的藜麦，通过不同诱变剂浓度及不同处理时间的EMS诱变处理，研究其对种子萌发及幼苗生长的影响。首先确定不同品系藜麦的最适EMS诱变的浓度和时间，再通过M0代藜麦诱变群体的构建，筛选获得不同性状的突变体，为藜麦种质资源创新和研究突变基因功能及了解基因间相互作用提供理想材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取目前云南省内主栽的白藜麦、红藜麦、黄藜麦和黑藜麦品系的种子。

1.2 试验设计

EMS设为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%等6个处理浓度，对照(ck)为0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.0)；诱变处理时间为：4 h、6 h、8 h、10 h、12 h等 5个处理，3次重复。

1.3 试验方法

1.3.1试 剂

EMS为化学纯(纯度>99%)，用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液配制成0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%浓度。

1.3.2EMS的处理浓度

选取籽粒饱满的4个品系的种子，每个处理100粒，分别放置于烧杯中，用20%的NaClO和1～2滴tween-100消毒15～20 min，用清水反复冲洗3次，之后用无菌水浸泡2 h至吸水饱和，分别加入不同浓度的EMS溶液浸泡，之后用0.5%硫代硫酸钠溶液冲洗3～5遍后，再用无菌水冲洗3～5次，去除残留的EMS溶液。将处理种子放入铺有湿润滤纸的培养皿中，再放入培养箱进行培养，培养箱的温度为(25±1)℃，7 d后分别统计发芽种子数和正常生长的苗数，并计算发芽率和成苗率。分别以蒸馏水浸泡的白、红、黄、黑藜麦作为对照。

1.4 发芽指标

发芽率、成苗率和相对发芽率等指标的统计，计算公式如下：

发芽率(%)=(7 d 内正常萌发种子数/供试种子数×100%;

成苗率(%)=(7 d 内正常成苗的藜麦数/萌发的种子总数)× 100%。

1.5 数据分析

数据用 Excel软件进行统计，采用SPSS 22.0软件进行相关性分析，多重比较和显著性检验，p<0.05。

表1 不同浓度的EMS处理对4种藜麦种子发芽率的影响Table 1 Effects of different EMS concentrations on the germination rate of four kinds of quinoa seeds

图1 不同浓度EMS诱变处理对藜麦成苗率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of EMS on seedling rate of Chenopodium quinoa Willd.

2 结果与分析

2.1 不同浓度的EMS诱变处理对4种藜麦种子的发芽率和成苗率的影响

由表1可看出，随EMS处理浓度的增加，4个品系藜麦种子的发芽率明显降低，EMS处理对藜麦种子的发芽具有抑制作用。不同品系的藜麦对处理浓度的敏感度存在差异。红藜麦对处理浓度最不敏感，而黑藜麦最敏感。当处理浓度为1.5%时，4个品系藜麦的发芽率都为80%，处理浓度大于2.0%时，黄藜麦和黑藜麦的发芽率明显下降。当处理浓度为3.0%时，红藜麦的发芽率达69.67%，而黑藜麦的仅有23.67%。白藜麦和黄藜麦具有相同的趋势，发芽率均在56%左右。当处理浓度为1.5%时，4个品系的藜麦的发芽率约为80%，因而，1.5%的处理浓度可选为EMS的诱变浓度。

由图1可以看出，随着EMS处理浓度的增加，藜麦的成苗率呈下降的趋势，不同品系的下降幅度存在差异。白藜麦、红藜麦和黄藜麦均呈现断崖式下降，而黑藜麦表现出逐渐下降的趋势。说明随EMS处理浓度的增加，对藜麦幼苗生长发育的抑制作用越强。当处理浓度≥1.5%时，红藜麦和黄藜麦的成苗率才开始出现显著差异，而当处理浓度>0.5%时白藜麦和黑藜麦的成苗率均显著下降。当处理浓度为3.0%时，红藜麦、白藜麦、黄藜麦的成苗率几乎为0，而黑藜麦的也仅为6.67%，3.0%的浓度是大部分藜麦幼苗的致死浓度。当处理浓度为1.5%时，红藜麦、黄藜麦、黑藜麦的成苗率约为50%，白藜麦的成苗率约为20%，因而，1.5%的EMS处理浓度可选为种子成苗的适合诱变浓度。

图2 1.5% EMS浓度下不同处理时间对4个藜麦种子发芽率的影响 Fig.2 Effects of different treatment time on germination rate of four Chenopodium quinoa Willd. under 1.5% EMS

2.2 1.5% EMS浓度下不同时间处理对4种藜麦种子的发芽率和成苗率的影响

从图2可以看出，1.5%的EMS处理浓度下，随着处理时间的增加，种子的发芽率明显降低，且显著低于ck。红藜麦和黄藜麦表现相同的骤然下降的趋势，而白藜麦和黑藜麦下降幅度小，下降比较平缓。处理4 h后，黄藜麦、白藜麦、黑藜麦种子的发芽率下降到60%左右，而红藜麦种子的发芽率仍为92.7%。处理6 h白藜麦的发芽率下降到49%，黑藜麦为66%，红藜麦为77.3%，黄藜麦最小，为20%。在处理8 h的情况下红藜麦种子的发芽率下降至32%。因而，EMS对黄藜麦的发芽率影响最大，而对黑藜麦种子发芽率的影响最小。

从图3可以看出，EMS对藜麦种子的成苗率与发芽率的影响呈现相同的趋势。藜麦种子在EMS浓度为1.5%时，随处理时间的延长，其成苗率逐渐降低，明显低于ck。处理4 h成苗率下降到35%～68%；在12 h时藜麦种子成苗率降为10%以下。因而4 h为最佳处理时间。

2.3 EMS诱变后产生的穗变异类型

通过1.5% EMS处理藜麦种子4 h，构建了5 000株诱变群体，筛选获得4种不同穗型的变异类型，表现为穗分支畸形、穗分支紧凑，且无侧枝穗分支、穗分支分散及穗不结籽粒的穗型性状的突变体(见图4)。

3 讨论与结论

3.1 EMS浓度和时间对藜麦种子萌发和成苗的影响

目前，我国主要以高产、高抗性、抗倒伏、抗穗发芽、早熟、高品质等作为藜麦的主要育种目标[17]。2014年我国首次通过系统育种和栽培驯化相结合的方法，选育出第一个藜麦新品种“陇藜1号”[1]。国内新品种选育进程缓慢，难以满足我国藜麦产业快速发展对优良种质的需求。由于藜麦的花序属于圆锥状花序，花序紧凑，花小而多，且具有两种大小的雌花、两种大小的两性花和无花被的小花共生等多样性复杂的花部结构特征[4]，属于非严格意义的自花授粉作物，变异较大，因此人工去雄难，通过杂交的传统育种难度大，时间周期长[1,4]，加之，藜麦引入我国的时间短，对常规育种(系统选育)、杂交、诱变及MAS (molecular marker-assisted selection)、GAS(genome assisted selection)的分子育种等方法的研究仍处于探索阶段[4,17]。而通过理化诱变、T-DNA插入、转座子标签、逆转座子插入、RNAi抑制基因表达等方法构建突变体库进行种质创新是常采用的方法体系之一[18]。在利用化学诱变进行突变体创制的研究中，EMS具有突变频率高，易产生点突变、显性突变的特点，在短时间内易筛选到目标性状的突变体，是目前最有效的化学诱变方法[8]。选择适宜的诱变条件对于获得理想突变性状是十分重要的，而诱变条件的选择与种子大小，种皮的透水性等因素密切相关[18]。藜麦种子小，千粒重一般为0.3～0.41 g，种胚在种子的最外围，呈环形，藜麦种皮具有透水性好，种子易于萌发的特点[19]。本实验设计0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%等6个EMS处理的浓度和4 h、6 h、8 h、10 h、12 h处理时间对藜麦种子发芽率和成苗率研究，结果发现，诱变剂EMS对藜麦种子的萌发和生长发育具有明显的抑制作用，且随处理浓度和时间的增加，其抑制作用增强。这与臧辉等[20]和王育川等[21]的研究结果一致。在诱变中判断半致死条件(50%存活率)是确定最佳诱变条件是否适宜的关键[21]。紫苏种子的EMS的半致死浓度为1.25%[10]，山羊草的EMS的半致死浓度为1.5%[18]。用4%浓度的EMS处理番茄干种子12 h 时，番茄种子的发芽率接近半致死[23]。王育川等[21]EMS处理白藜麦种子的实验中，1.5%的EMS浓度处理12 h为诱变的最佳条件，相对致死率为48.7%，2.0%浓度处理8 h或10 h相对致死率也接近半致死剂量。对于诱变群体来说，50%的致死率对于种子的萌发率来说是最佳处理条件，但是对于种子的成苗率、幼苗的成活率及完成全生育期的数量都有极大的影响。常导致用种量大、植株在生长发育过程中未发育，完全生育期的死亡率增加，不利于构建适合的筛选群体。生产上也以种子萌发80%为判断种子质量的标准。因此可以认为，80%的发芽率作为最适的EMS处理浓度更为合理。实验结果表明，对于种子萌发来说，EMS的最适处理浓度为1.5%。且EMS对于幼苗成苗的影响大于对种子萌发的影响，且不同的藜麦对EMS的敏感性不同。1.5%的EMS浓度处理白藜麦和红藜麦种子6 h，发芽率接近80%，而成苗率却下降到20%和40%，白藜麦最敏感。这可能与白藜麦种子的种皮几乎不含皂苷有关，而其他3个藜麦种子种皮中均含有不同含量的皂苷。王育川等[21]认为，可能与藜麦种子的种皮品质有关。白藜麦和黄藜麦对EMS敏感，而红藜麦和黑藜麦对EMS不敏感。这可能与红、黑藜麦籽粒外壳皂苷含量有关。

图3 1.5%的EMS浓度下不同时间处理对4种藜麦成苗率的影响 Fig.3 Effects of different treatment time on seedling rate of four kinds of Chenopodium quinoa Willd. under 1.5% EMS

注：1为穗分支畸形；2为穗分支紧凑，且无侧枝穗分支;3为穗分支分散；4为穗不结籽粒；5为对照藜麦。 图4 EMS诱导藜麦获得的4种不同穗型的M0代变异类型植株 Fig.4 M0 generation Chenopodium quinoa Willd. plants with four different panicle types obtained by EMS mutagenesis

3.2 穗型变异的突变体植株的获得

构建饱和突变群体是突变体筛选、分析鉴定、基因功能研究的重要途径[24]。已利用EMS诱变拟南芥，构建了大量的突变体库，获得具有不同生育期、株高、叶片性状、穗部性状、分蘖、育性等明显表型的突变体应用于育种及基因功能研究[10,25]。在农作物的研究中，张凤启等[13]利用0.4%EMS处理甘蓝型油菜种子，从4.8万株M2代群体中筛选出包括子叶、叶片、花器官、角果和株型等具有突变性状的甘蓝型油菜变异植株。陈忠明等[26]通过EMS处理水稻93-11，构建了271个突变体库。许云峰等[27]利用诱变处理小麦品种，筛选得到11个农艺性状发生明显变异的突变植株。虽然藜麦是一种古老的作物，却是迄今为止人为进行遗传改良最少的作物之一。目前采用EMS诱变是获得藜麦新种质的一种快速有效方法。Imamura等[28]通过EMS诱变藜麦，获得大约2 000粒诱变种子，M3代观察到了下胚轴色素沉着的藜麦突变体。Tropa-Castillo[29]利用1.0%和2.0%浓度的EMS、8 h处理藜麦种子，获得抗除草剂和不同株高的突变体。Arias-Montero[30]利用化学诱变剂叠氮化钠处理藜麦30 min，也获得高皂苷和蛋白质含量的突变体。本研究通过最佳EMS处理5 000粒藜麦种子，构建了藜麦M0代诱变群体，通过M0代植株表型观察，筛选获得4株穗型变异的突变体植株。

3.3 结 论

EMS处理对4种藜麦种子的发芽和幼苗生长有明显的抑制作用。不同的藜麦品系具有差异性，白藜麦和红藜麦对EMS敏感。EMS对于幼苗的影响大于对种子萌发的影响。 EMS诱变白藜麦和红藜麦种子的最佳处理条件为1.5%的浓度下处理4 h，黄藜麦和黑藜麦的最佳处理条件为1.5%处理6 h。该EMS处理条件下，成功构建了白藜麦的诱变M0代群体，筛选获得4株穗型变异的突变体类型，为后续这些突变性状的表型数据调查、遗传分析、突变基因功能研究及种质创新提供了良好的实验材料。