林扬， 杨宇豪， 蒋启凌(综述)， 魏雅岚， 佘振宇(审校)

驱动蛋白Eg5(kinesin-5)，又名驱动蛋白超家族成员11(kinesin family member 11，KIF11)，是一种广泛表达于人体正常组织的蛋白，对纺锤体微管组装、染色体排列和分离具有重要作用。在有丝分裂前期，Eg5蛋白定位于纺锤体微管和中心体，且沿微管正向运动。在有丝分裂的前中期，Eg5蛋白协同驱动蛋白-14调控中心体分离，维持纺锤体结构并促进染色体排列。同时，周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，Cdk1)通过磷酸化激活Eg5蛋白，调控纺锤体微管组装[1]。

据报道，Eg5蛋白在多种恶性肿瘤中异常表达。因此，Eg5蛋白作为抗肿瘤药物的作用靶点，其抑制剂在肿瘤化疗过程的作用受到广泛关注。从作用机制来看，相比于抗微管药物或免疫抑制剂，Eg5抑制剂的抗肿瘤活性和特异性更强。Eg5抑制剂作为抗肿瘤药物，其临床前的基础研究结果较有意义，但临床上单药治疗效果不佳。基于药物合成和用药方案的进一步研究，研究人员合成了更多种类的Eg5抑制剂，并且改进了部分药物的用药方案。本综述探讨Eg5蛋白在细胞分裂过程中的功能及其抑制剂的抗肿瘤机制，并深入分析Eg5抑制剂在临床应用方面的潜力及其意义。

1 Eg5蛋白的结构及其在细胞周期中的调控机制

Eg5蛋白由N端的马达结构域、螺旋卷曲结构域和C端的尾部结构域构成。在真核细胞中，Eg5蛋白利用ATP水解释放的能量，沿微管正向运动。Eg5蛋白的尾部结构域可抑制其与ATP的结合，减缓Eg5蛋白的运动速度，并与微管产生较强的作用力。Eg5蛋白协助纺锤体组装和中心体分离，从而调控染色体排列和分离。

从G2期到M期，Eg5同源四聚体通过螺旋卷曲结构域交联反向平行微管。同时，Eg5蛋白拮抗平衡驱动蛋白KIFC1和动力蛋白(dynein)在微管上的作用力，共同调控双极纺锤体的形成。在G2晚期，Eg5蛋白通过影响纺锤体的方向和长度，维持中心体在细胞核附近的定位。在有丝分裂前期，Eg5蛋白聚集于极间微管，产生作用于反向平行微管的向外作用力，最终促进极体分离。Eg5蛋白缺失导致复制后的中心体分离异常，形成单极纺锤体，诱导有丝分裂停滞[2]。此外，Eg5蛋白促进纺锤体微管的延伸、胞质流动和细胞迁移[3]。Eg5蛋白亦可协助驱动蛋白KIF15向赤道板运动，调控动粒微管组装和染色体排列。

在细胞分裂过程中，Src家族激酶通过磷酸化Eg5蛋白马达结构域的Tyr-125、Tyr-211和Tyr-231 位点，调控纺锤体两极分离。在有丝分裂后期，Eg5蛋白的Cdk1磷酸化位点发生磷酸化，促进Eg5蛋白从纺锤体两极迁移至纺锤体或中间体[4]。此外，Eg5蛋白通过磷酸化改变动粒微管伸展方向，限制细胞分裂后期微管的过度延伸，从而调控纺锤体微管结构[5]。

2 Eg5蛋白的抑制剂及其靶向Eg5蛋白的作用机制

研究表明，Eg5蛋白在肝细胞癌、膀胱癌和神经胶质瘤等实体瘤中高表达，且与肿瘤细胞的迁移能力和肿瘤预后密切相关[6-8]。Eg5蛋白可通过调控纺锤体长度参与结肠癌的病灶转移[9]。在细胞间期，胞质内Eg5蛋白的分布与激素单纯性前列腺癌的发生相关，而细胞核内Eg5蛋白上调导致肿瘤加速转变为转移性前列腺癌[10]。近年来，有关Eg5抑制剂在肿瘤治疗的研究进展较多，具有临床应用价值。

根据作用靶点的不同，Eg5蛋白的特异性抑制剂分为两类：(1)一类是以早先发现的Monastrol及其喹唑啉酮同源物S-三苯-甲基-L-半胱氨酸(S-trityl-L-cysteine，STLC)和Ispinesib为代表。此类药物通过结合并诱导Eg5蛋白的helix(螺旋)α2/loop L5(插入环可变区5)和helix α3的构象变化，使微管诱导的ATP酶活性降低。(2)另一类是ATP竞争性结合抑制剂，可特异性作用于Eg5蛋白的helix α4/α6位点，通过影响Eg5蛋白运动过程的构象转换，使ATP无法结合和水解。这两类变构竞争性抑制剂主要是限制Eg5蛋白沿着微管的运动功能。

2.1 helix α2/loop L5和helix α3靶向抑制剂

2.1.1 Monastrol 通过表型筛查发现的小分子抑制剂Monastrol，可特异性结合至Eg5蛋白的马达结构域并诱导其发生变构，从而抑制Eg5蛋白与微管结合所引起的ADP释放[11]。同时，Monastrol诱导的Eg5蛋白构象变化，使得Eg5蛋白与微管紧密结合，抑制了Eg5蛋白沿微管的正向运动[12]。此外，特定催化状态下形成的Eg5-ADP-Monastrol复合体，以极弱的分子摩擦阻力沿着反向平行微管缓慢滑行，破坏了Eg5蛋白与驱动蛋白14的平衡，导致反向平行微管分离异常[13]。

2.1.2 STLC 大蒜中提取的STLC是一种与Eg5蛋白紧密结合的选择性变构抑制剂。STLC通过降低Eg5-ADP与磷酸基团结合的紧密程度，抑制中心体分离，诱导单极纺锤体形成，导致有丝分裂停滞和细胞凋亡。此外，STLC诱导loop L5向下摆动，关闭抑制物结合袋的入口，稳定Eg5蛋白与STLC的结合[14]。STLC的作用机制与Monastrol类似，但前者与Eg5蛋白的结合更紧密。同时，STLC通过抑制loop L5的结构变化，使Eg5蛋白无法以运动状态结合至微管，达到更强抑制效果。另外，STLC对Eg5蛋白微管扭转力的抑制扰乱了纺锤体微管的顺时螺旋结构，破坏了纺锤体的手性结构[15]。

2.1.3 藤黄双黄酮(Morelloflavone) 植物中提取的Morelloflavone通过紧密结合Eg5蛋白抑制Eg5蛋白的纺锤体组装功能。与STLC不同，Morelloflavone使Eg5蛋白与ADP形成更为稳定的构象，抑制了Eg5-ADP和Eg5-ATP的构象转化，降低了Eg5蛋白与ATP和微管的亲和力。同时，Morelloflavone抑制了ATP酶活性，影响Eg5蛋白沿微管运动的功能[16]。

2.1.4 伊斯平斯(Ispinesib) 作为第一个进入临床化疗的小分子Eg5抑制剂，Ispinesib与STLC类似，通过诱导Eg5蛋白构象变化而降低Eg5-ADP与磷酸基团结合的紧密程度。Ispinesib不受限于Eg5蛋白的催化位点状态及与微管的结合状态，可结合到loop L5，并提前诱导连接结构域(neck linker)的结合[17]，通过阻止ADP的释放而抑制Eg5蛋白的微管运动。

2.1.5 非兰尼塞(Filanesib，Arry-520) Filanesib是目前处于临床开发阶段、高选择性的小分子Eg5抑制剂。Filanesib通过结合到Eg5蛋白的马达结构域达到抑制效果。同时，在Eg5高表达的血液瘤细胞中，survivin的表达使Filanesib的抑制活性增强[18]。免疫缺陷小鼠模型及血液瘤患者的实验结果也表明，机体对Filanesib的合理用药较Ispinesib具备更良好的耐受性[19-20]。

2.1.6 K858 K858是基于表型筛查的小分子Eg5抑制剂，抑制Eg5蛋白的作用，使得细胞形成四倍体。K858是在癌症治疗中较常用的Eg5抑制剂，能够降低胃腺癌细胞的侵袭性。与其他抑制剂一致，K858不抑制微管聚合，因此并不具备明显的细胞神经毒性[21]。

2.1.7 Dimethylenastron 相较于二氢嘧啶同源物，Dimethylenastron具备与Eg5蛋白变构位点更高的亲和力，使Eg5-ADP构象更为稳定，可有效抑制Eg5蛋白的作用活性，并上调热休克蛋白70的表达。作为化疗药物，Dimethylenastron的副作用相对较小，且不影响Eg5蛋白与微管的相互作用[22]。

2.1.8 AZD4877 AZD4877作为化学合成的Eg5选择性抑制剂，可作用于变构位点，抑制Eg5蛋白的微管运动。因其具有良好的药代动力学特性和活性，在肿瘤疾病治疗中具有潜在价值[23]。

2.1.9 YL001 YL001是计算机辅助药物设计出的STLC类似物，其结构异于其他Eg5抑制剂。YL001不仅抑制Eg5蛋白的ATP酶活性，而且可使Eg5蛋白过度磷酸化，从而抑制Eg5蛋白沿微管运动。YL001在黑色素瘤细胞及耐药株中抑制活性明显[24]。

2.2 helix α4/α6靶向抑制剂

2.2.1 GSK-1和GSK-2 双芳基化合物GSK-1和GSK-2靶向定位于helix α4/α6位点之间，抑制了Eg5蛋白沿微管运动时连接结构域的构象变化，从而影响ATP的水解及循环。因此，可诱导单极纺锤体的形成和细胞周期停滞，并可对Ispinesib耐药细胞株产生抑制效用[25]。

2.2.2 哒嗪类药物(Pyridazine analogs) 高通量虚拟筛选出的Pyridazine类药物，对Eg5蛋白具有良好的亲和力，与ATP竞争性结合Eg5蛋白的helix α4/α6 位点，从而有效抑制Eg5蛋白[26]。同时，机体对Pyridazine类药物具有良好的吸收、代谢和排泄能力[26]。

3 Eg5抑制剂的抗肿瘤活性与机制

基于Eg5抑制剂的作用机制，以及Eg5蛋白在肿瘤细胞中的异常表达，关于Eg5抑制剂的亚临床研究有一定进展。在胶质母细胞瘤中，K858通过抑制纺锤体微管组装和激活纺锤体组装检验点，长期给药诱导有丝分裂细胞死亡、多倍体形成和细胞衰老，实现抗肿瘤作用[21]。体外研究发现，AZD4877具备良好的药代动力学特性，且对胃肠道、膀胱及血液等组织器官的肿瘤细胞系的增殖有抑制效果。在黑色素瘤异种移植的小鼠模型中，YL001的肿瘤抑制效果使小鼠生存率提高至60%[24]。以上研究表明了Eg5抑制剂的抗肿瘤活性，相关作用机制值得进一步探讨。

3.1 抗肿瘤细胞增殖活性 Eg5蛋白通过调控细胞分裂纺锤体组装在细胞周期中发挥重要作用。Eg5抑制剂AZD4877能有效诱导晚期人结肠癌等实体瘤细胞单极纺锤体的形成[23,27]，激活纺锤体组装检验点，从而活化泛素连接酶APC/C，使细胞停滞在G2/M期。另外，Eg5抑制剂可诱导肿瘤细胞躲避有丝分裂的阻滞作用，沉默纺锤体组装检验点，发生有丝分裂逃逸，使细胞停止在G1期或形成多倍体[21-22]，从而达到广泛的抗肿瘤增殖活性。在此基础上，Eg5抑制剂对肿瘤细胞的凋亡诱导进一步实现了其抗肿瘤活性。

3.2 诱导肿瘤细胞凋亡活性 Eg5抑制剂诱导的细胞凋亡主要通过激活细胞内源性凋亡通路完成，并依赖纺锤体组装检验点抑制异常的细胞增殖并引发凋亡。细胞周期检查点激酶1(cell cycle checkpoint kinase，CHK1)和Eg5蛋白的靶向抑制可影响ER+/PR+/HER2-乳腺癌肿瘤细胞的存活[27]。在检验点蛋白BubR1/Mad2缺失的情况下，Monastrol并没有达到抑制肿瘤生长的作用[28]。在纺锤体组装检验点完全缺失的情况下，Eg5抑制剂诱导的非整倍体细胞的形成反而促进肿瘤发生。同时，抑制剂YL001及K858可激活凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase 3/9)，从而促进肿瘤细胞凋亡[21,24]，而STLC的衍生物则通过使聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)裂解而诱发细胞凋亡[29]。此外，Eg5抑制剂更易诱导血液恶性肿瘤细胞发生凋亡[18]。

肿瘤细胞的凋亡与肿瘤的发生进程息息相关，并与肿瘤细胞的异质性有关。凋亡依赖抑癌基因p63在浸润性膀胱癌而非早期膀胱癌中高表达。AZD4877可诱导浸润性膀胱癌细胞的p63基因及其下游靶点c-myc基因的表达[30]。通过c-myc、周期蛋白等S期促进因子上调Eg5蛋白的表达水平，提高肿瘤细胞对Eg5抑制剂的敏感性。另外，乳腺癌细胞中蛋白酶B(AKT)的抑制显著下调了凋亡抑制基因survivin，使K858达到更强的诱导细胞凋亡效果[21]。综上所述，Eg5抑制剂的肿瘤杀伤作用与PI3K/AKT信号通路密切相关。此外，Monastrol作为实体瘤中高表达的NAD(P)H脱氢酶1的结合底物，可激活氧化应激反应，从而诱发肿瘤细胞凋亡[7-8]。基于部分Eg5抑制剂的抗氧化性，探究其在含大量自由基的肿瘤细胞中的应用具有较好的研究前景。因此，深入探究肿瘤细胞的凋亡机制及其与Eg5抑制剂的联系，对肿瘤的临床治疗具有指导意义。

3.3 肿瘤细胞耐药性 获得性耐药常见于转运体活性改变或药物靶点突变的肿瘤细胞。最早发现的Eg5天然抑制剂Terpendole E及其生物制剂仅影响Eg5蛋白与微管的连接[31]。而以Monastrol为代表的药物则靶向作用于Eg5蛋白马达结构域的helix α2/loop L5和helix α3区域。因为Eg5蛋白的N端结构域是抑制剂的作用靶点，其突变将导致细胞耐药。loop L5调控Eg5蛋白与Monastrol/STLC等抑制剂的变构结合，抑制剂易诱导Eg5蛋白loop L5(D130A/A133D)位点突变，使肿瘤细胞产生耐药且不丧失酶活性，而helix α3(L214A)位点的突变却使肿瘤细胞对Ispinesib更为敏感[32-33]。另一靶点helix α4/α6的突变可抵抗Pyridazine类药物或GSK-1对Eg5蛋白的抑制作用[25-26]。不同靶点药物的联用可较好抑制Eg5蛋白的纺锤体组装功能。同时，变构竞争性抑制剂与活性中心竞争性酶抑制剂的组合可有效避免靶点突变导致的细胞耐药性。进一步探究核苷酸位点结合抑制剂(如噻唑类药物)，对Eg5抑制剂的临床应用也有一定意义。

有趣的是，Eg5蛋白的C端结构域截断突变能够使肿瘤细胞对STLC耐药，并通过促进自身磷酸化维持极间微管的交联和KIF15的正确定位[34]。此外，K858导致的survivin表达上调[21]，以及Dimethylenastron导致的热休克蛋白70表达上调[22]，使得肿瘤细胞对化疗敏感性下降。而在Monastrol耐药细胞中表达升高的circRNAs-MTO1，通过抑制Eg5蛋白的翻译杀伤乳腺癌细胞，同时改善了肿瘤细胞对Monastrol的耐药性[35]。一般来说，除了微管蛋白的突变和微管动力学改变，紫杉醇(Taxol)耐药细胞的形成还与P-糖蛋白的表达呈正相关。然而，小分子Eg5抑制剂对细胞的作用并不依赖P-糖蛋白。因此，探究肿瘤细胞对Eg5抑制剂的耐药性形成机制可为临床化疗方案提供参考。

4 Eg5抑制剂的临床应用及其进展

4.1 单药的临床应用进展 在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，AZD4877虽然对晚期实体瘤和难治性血液瘤表现出较好的Eg5蛋白抑制效果，但疗效欠佳[36]。同时，Ispinesib在复发或转移性黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌无明显疗效[37-38]。然而，肿瘤细胞内Eg5蛋白的高表达仍是治疗靶点的有利支持。基于Eg5抑制剂良好的体外抗肿瘤活性，以及Ispinesib和AZD4877等良好的机体耐受性，研究人员进一步探究了Eg5抑制剂对肿瘤患者的疗效。超过阈值剂量的Filanesib与地塞米松及蛋白酶体抑制剂联用，对难治性恶性血液肿瘤具有效用[19-20]。因此，进一步研究Eg5抑制剂与其他药物的联用以及用药剂量和用药时效等具有一定临床价值。

4.2 Eg5抑制剂与抗微管活性药物的联用 抗微管活性药物影响间期囊泡运输而产生神经毒性，所以机体耐受性相对较差。与常规抗微管活性药物相比，Eg5抑制剂Monastrol对肿瘤具有更好的特异性[39]，并且STLC对紫杉醇或吉西他滨耐药肿瘤细胞依旧有效[40]。长春碱协同Monastrol或Ispinesib在ER-/PR-/HER2-乳腺癌细胞系表现出更高效的选择性[41]。因此，Eg5抑制剂能够补充抗微管活性药物的抗肿瘤活性。

另外，Ispinesib与多烯紫杉醇联用对晚期实体瘤患者产生可耐受的细胞毒性和非积累性的中性粒细胞减少[42]，表明二者联用存在一定可行性。然而，紫杉醇反而降低Eg5抑制剂对卵巢癌及乳腺癌的效用[43]。沙戈匹隆(Sagopilone)对广泛的异质性乳腺癌具备较紫杉醇更好的效果，但其与Eg5抑制剂并无抗肿瘤的协同效应[44]。此外，药物使用导致survivin表达的上调和凋亡信号的分子改变等亦影响二者的联用效果[21]。进一步探究Eg5抑制剂与抗微管活性药物的组合，可为Eg5抑制剂的临床用药提供更多元化的方案。

4.3 Eg5抑制剂与免疫抑制剂的联用 通过联用免疫抑制剂，机体对药物表现出良好的耐受性。临床试验中也发现了Ispinesib增强曲妥珠单抗、拉帕替尼的抗肿瘤活性[45]。临床Ⅰ/Ⅱ期实验中，Filanesib与地塞米松及泊马度胺、卡非佐米(Carfilzomib)等蛋白酶体抑制剂联用表现出对难治性多发性骨髓瘤更好的效用[19-20]。通过延长超过阈值浓度Ispinesib及Filanesib等药物的暴露时间，使更多的细胞进入药物敏感期，可优化抑制剂的疗效[38]。此外，低剂量的紫杉醇与免疫抑制剂的联合应用足以支持抗肿瘤的免疫检测[46]。未来的研究重点不仅是调整Eg5抑制剂与免疫抑制剂的化疗方案，更重要的是通过免疫检测判断药物效用和机体免疫应答能力。

4.4 Eg5抑制剂对不同种类肿瘤的疗效差异 雌激素受体阳性的乳腺癌细胞对STLC和Monastrol的肿瘤抑制效果更为敏感[47]，但雌激素并不会强化其他肿瘤细胞对Eg5抑制剂的敏感性。相反，MTO1的上调会抑制癌症细胞中Eg5蛋白的表达水平[35]。这说明不同种类的肿瘤细胞可通过不同因素调节Eg5蛋白水平。因此，临床疗效欠佳理应考虑到协作Eg5蛋白功能的因子，以及机体长期用药而导致此类因子的表达异常而导致耐药。这不仅可解释临床上Eg5抑制剂对不同分化及不同种系的肿瘤细胞的差异性效用，还为Eg5蛋白作为癌症临床治疗靶点提供新的研究思路。

5 展 望

驱动蛋白Eg5在有丝分裂中的重要性使其成为肿瘤化疗药物的研究热点。Eg5抑制剂通过诱导Eg5蛋白运动域构象变化，从而表现出更强的抑制效果。Eg5抑制剂通过激活纺锤体组装检验点和氧化应激反应，从而诱导细胞凋亡，在体外表现出高效的抗肿瘤活性。但是，Eg5抑制剂在临床现有的试验数据中并未表现出良好的肿瘤疗效，有待进一步研究。

细胞耐药性形成与Eg5蛋白结构突变或其他相关蛋白异常表达有关。进一步探究Eg5抑制剂与其他抗肿瘤药物的联系，或研究相关分子对肿瘤细胞Eg5蛋白功能的影响，对优化药物抗癌效用有积极的临床意义。同时，抑制剂诱导变构的两个不同结合位点，对临床联合用药提高Eg5抑制剂的抗肿瘤的有效性和患者生存率提供了新的可能。以上思路可以为未来优化Eg5抑制剂在肿瘤治疗中提供借鉴和参考。