魏永， 张俊榕， 潘杰， 翁宗奇， 陈先强

术后肠梗阻(postoperative ileus, POI)是外科术后常见的并发症，发生率为10%～30%[1-2]。POI的发病机制比较复杂，至今尚未完全阐明，其中炎症反应是POI的主要机制。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)14和MAPK3是炎症反应中最重要的激酶之一，参与炎症反应的发生、发展并发挥调控作用。NR4A1(nuclear receptor subfamily 4， group A-1)是孤核受体家族之一，是免疫稳态的重要调节因子。多种细胞外刺激因素，如缺氧、炎症、细胞应激等可诱导NR4A1快速表达[3-4]。已有研究表明，NR4A1作为一种响应蛋白，在信号传导的早期发挥作用，可调控MAPK激酶和炎症因子的表达，从而参与炎症反应[5-6]。本研究拟建立大鼠POI模型，检测NR4A1、MAPK14、MAPK3和白细胞介素6(interleukin， IL-6)的表达，探讨NR4A1调控POI炎症反应的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 18只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，体质量(180±20) g，福建医科大学实验动物中心[动物批号：SCXK(闽)2016-0002]饲养(普通饲料饲养，温度20～26 ℃，湿度40%～70%)。本研究已获得福建医科大学实验动物委员会批准。

1.1.2 主要试剂 CytosporoneB (CAS321661-82-5，美国Glpbio公司)；NR4A1(DF7850，江苏Affinity公司)；MAPK14(别名p38α， ab170099，英国Abcam公司)；MAPK3(别名ERK1,16443-1-AP，美国Proteintech公司)；IL-6酶联免疫吸附试验ELISA(MM-0190R1，武汉Elabscience公司)；TUNEL检测试剂盒(C1088，上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 POI造模 大鼠术前禁食12 h，可饮水。2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后四肢固定于手术台上，腹部备皮后碘伏消毒铺巾。做下腹部正中线长约3 cm切口，依次切开皮肤、腹壁肌肉后进腹。取出全部小肠外置于两层湿纱布间，用盐水湿纱布由小肠末端自下而上擦拭肠管至幽门环，反复6次，用时10 min，期间注意防止损伤肠系膜血管。将全部肠管放回腹腔，注意理顺小肠，防止其扭转。1-0丝线分层连续缝合肌肉及皮肤关腹。假手术组大鼠腹部只做进腹和关腹处理。动物麻醉清醒后禁食不禁水，注意保温。

1.2.2 动物分组 将18只SD大鼠数字随机分成3组：假手术组、模型组(POI模型)和激动剂组(POI模型+CytosporoneB)，每组6只。激动剂组大鼠术前1 h腹腔注射CytosporoneB (13 mg/kg)；假手术组和模型组大鼠术前1 h腹腔注射同等剂量磷酸盐缓冲液。饲养48 h后大鼠进行1 mL墨汁灌胃处理，灌胃后30 min麻醉各组大鼠，开腹观察小肠形态，测量小肠推进率，取腹主动脉血液和距离盲肠10 cm的一段回肠组织样本做相关指标检测。

1.2.3 腹腔内小肠形态情况 打开腹腔，肉眼观察小肠形态情况，包括肠管有无积气、积液、充血、水肿。

1.2.4 小肠推进率测量 将不同组大鼠处死后取出整段小肠(保留胃、盲肠)，测量小肠长度L1及幽门到墨汁最远处的距离L2，计算小肠推进率：

小肠推进率=(L2/L1)×100%

1.2.5 组织病理学检查 将肠组织固定于4%甲醛溶液，乙醇脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin， H-E)染色。采用光学显微镜观察肠道组织的病理改变。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡情况 石蜡切片预处理准备、烤片、脱蜡、水化、修复、洗涤，加TUNEL检测液、封片镜检。

1.2.7 免疫组织化学检测NR4A1表达 石蜡切片烤片、脱蜡、水化、修复、洗涤、一抗NR4A1(1∶100)磷酸盐缓冲液浸洗玻片，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，磷酸盐缓冲液充分淋洗。DAB显色、苏木精复染、盐酸酒精分化、返蓝、脱水、透明、封片、镜检。

1.2.8 免疫荧光检测MAPK14和MAPK3表达 石蜡切片包埋、切片脱腊水化、抗原修复、通透、封闭、一抗孵育MAPK14 (1∶150)和MAPK3 (1∶50)、荧光二抗cy3 (1∶150)、复染核、封片。

1.2.9 ELISA法检测IL-6水平 取大鼠血液及回肠组织样本进行处理，分离血浆，采用双抗夹心法加样、加酶、温育，覆膜置于37 ℃温箱60 min，配液，洗涤，甩干，洗涤5次，拍干，加入显色剂，37 ℃避光显色，加终止液，酶标仪分析。

2 结 果

2.1 免疫组织化学检测肠组织中NR4A1蛋白表达情况 假手术组中可见大量NR4A1蛋白，呈棕黄色。与假手术组比较，模型组中的棕黄色程度明显减少，仅少数阳性颗粒在细胞核中表达，NR4A1蛋白表达明显降低；与模型组比较，激动剂组中的棕黄色程度明显增加，NR4A1蛋白表达明显升高(图1)。

A：假手术组；B：模型组；C：激动剂组。NR4A1：孤核受体。图1 大鼠肠组织NR4A1表达Fig.1 Expression of NR4A1 in intestinal tissue of rats

2.2 肠组织病理形态学、细胞凋亡及小肠推进率情况

2.2.1 病理形态学 假手术组为正常的肠组织结构，无明显形态改变。与假手术组比较，模型组的肠组织水肿严重，细胞边界不清，具有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，激动剂组的肠组织炎性浸润程度具有明显的改善(图2A)。

2.2.2 TUNEL检测细胞凋亡结果 与假手术组比较，模型组肠组织中细胞凋亡明显升高，差别有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，激动剂组肠组织中细胞凋亡明显降低，差别有统计学意义(P<0.01，图2B)。

2.2.3 小肠推进率情况 与假手术组比较，模型组中小肠推进率显著降低，差别有统计学意义(P<0.000 1)；与模型组比较，激动剂组小肠推进率显著提高，差别有统计学意义(P<0.000 1，图2C)。

DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；Apoptotic cell：凋亡细胞；Merge：融合。Sham：假手术组；Model：模型组；Stimulator：激动剂组。A：病理H-E染色；B：细胞凋亡；C：小肠推进率。与Sham组比较，△：P<0.01，△△△： P<0.000 1；与Model组比较，△：P<0.01，△△△：P<0.000 1。图2 肠组织病理学检查、细胞凋亡及小肠推进率情况Fig.2 Pathological examination of intestinal tissue, apoptosis and small intestine propulsion rate

2.3 免疫荧光检测MAPK14和MAPK3的表达 与假手术组比较，模型组中MAPK14和MAPK3显著上调，差别有统计学意义(P<0.000 1)；与模型组比较，激动剂组中MAPK14和MAPK3显著下调，差别有统计学意义(P<0.000 1)。MAPK14和MAPK3激活下可诱导炎症反应，NR4A1激动剂显著抑制MAPK14和MAPK3的表达，进而抑制炎症因子(图3)。

DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge：融合；MAPK：丝裂原活化蛋白激酶；ERK:细胞外调节蛋白激酶。Sham：假手术组；Model：模型组；Stimulator：激动剂组。A：MAPK14表达；B：MAPK3表达。与Sham组比较，△△△：P<0.000 1；与Model组比较，△△△：P<0.000 1。图3 肠组织MAPK14和MAPK3表达情况Fig.3 Expression of MAPK14 and MAPK3 in intestinal tissue

2.4 IL-6含量水平变化 与假手术组比较，模型组血浆和肠组织中IL-6含量升高，差别有统计学意义(P<0.000 1)；与模型组比较，激动剂组血浆和肠组织中IL-6的含量降低，差别有统计学意义(P<0.000 1，P<0.001，图4)。

IL-6：白细胞介素6。Sham：假手术组；Model：模型组；Stimulator：激动剂组。A：血浆；B：肠组织。与Sham组比较，△△△：P<0.000 1；与Model组比较，△△：P<0.001；△△△：P<0.000 1。图4 血浆和肠组织IL-6含量水平Fig.4 IL-6 level of plasma and intestinal tissue

3 讨 论

POI是腹部外科手术后常见的并发症，与手术创伤程度、炎症反应、术后疼痛、阿片类药物、应激等多因素有关[7]。POI的主要临床表现为腹胀、恶心、呕吐、腹痛不明显及肛门停止排气、排便等症状。POI可导致患者推迟进食时间、延长住院时间、降低手术疗效及增加额外医疗费用等。虽然微创技术持续发展，手术方法也不断改进，但POI仍不可避免发生。

POI发生和发展的机制十分复杂，涉及多方面因素相互作用，分为早期阶段和持续阶段。POI的持续阶段主要是肠组织炎症反应作用，其持续时间与肠肌层炎症反应的程度呈正相关[8]。抑制炎症反应是防治POI最直接和最有效的方法。POI的炎症反应机制涉及多个信号传导通路共同作用。手术操作刺激胃肠道1 h即可激活细胞内MAPK14(p38α)、MAPK3(ERK1)、JNK/SAP等炎症反应相关的信号通路，引起一系列连锁反应，导致肠道部位的巨噬细胞和肥大细胞激活和核转录因子的活化，从而产生和释放大量IL-6、TNF-α及IL-1等促炎细胞因子和趋化因子，其中IL-6 在炎症反应中具有广泛的影响。IL-6等促炎因子激活中性粒细胞，引起肠道的炎症反应，最终导致POI的发生[9-11]。ZHU等[12]发现，结直肠癌术后发生POI患者的腹腔引流液中IL-6、TNF-α等炎症因子含量水平明显升高，腹腔炎症因子可预测POI的发生及持续时间。ZHANG等[13]发现，激活p38MAPK、ERK1/2信号通路可诱导细胞的炎症反应，抑制p38可降低IL-6和TNF-α表达水平，抑制ERK1/2可降低IL-6表达水平。WEHNER等[10]的研究表明，抑制小肠常驻巨噬细胞中p38信号通路可以有效预防POI。XIONG等[14]的研究发现，通过阻断p38/MK2信号通路可以有效地抑制小鼠POI中炎症因子表达，减少炎症细胞的浸润，从而减轻肠道炎症。因此，通过抑制MAPK信号通路，可以预防或减轻POI炎症反应，改善肠梗阻症状。

NR4A1属于孤核受体家族的重要一员，参与多种细胞过程，包括增殖、分化、凋亡、代谢和发育。NR4A1在免疫稳态、动脉粥样硬化、代谢类疾病、肿瘤的发生、发展等过程中扮演着重要角色[15-16]。最近有研究表明，NR4A1在炎症反应中具有负性调节作用[5-6,17]。NR4A1是一种磷酸化的蛋白。磷酸化可以调节NR4A1的活性，在刺激或炎症反应时可激活MAPK激酶，导致NR4A1的磷酸化。NR4A1处于失活状态，促进核因子NF-κB进入细胞核内，与 NF-κB位点结合，促进下游细胞因子IL-6、TNF-α释放大量炎症因子，进一步导致局部或全身炎症反应[18-19]。NR4A1在巨噬细胞和单核细胞中表达降低，而炎症因子(如IL-1和IL-6)表达升高[3-4]。HAMERS等[20]发现，NR4A1通过抑制p38MAPK和NF-κB表达而降低ET-1水平，ARDS大鼠肺组织中NR4A1表达明显降低，NR4A1激动剂CytosporoneB减轻了ARDS的炎症和损伤。ANOUK等[21]发现，小鼠结肠炎模型中敲除NR4A1基因，结肠炎症明显加重，激活NR4A1表达可减轻结肠炎症。本研究结果显示，大鼠POI肠组织中NR4A1表达明显降低，MAPK14、MAPK3及IL-6的表达显著升高；CytosporoneB激活NR4A1表达可显著降低MAPK14、MAPK3及IL-6表达，减轻肠组织的炎症和水肿，提高小肠推进率。

综上所述，大鼠POI肠组织中NR4A1低表达在炎症反应及POI进展中起着重要作用。激活NR4A1表达可减轻POI肠组织炎症和缓解梗阻症状，其作用机制可能与通过抑制MAPK信号通路有关。