韦晓?龚获权?冯玉燕?吉忻

摘要：利用低浓度氧化石墨烯（GO）作为以PVA-124为成膜基质的新型液体创可贴的抑菌成分，测试最佳抑菌浓度以及对大鼠创面愈合VEGF表达及创面愈合的影响。研究表明GO含量为120 mg/mL抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌效果较佳。各组不同时间创面愈合率均无明显差异（P>0.05），各组不同时间之间VEGF阳性占比比较无显著差异P>0.05，氧化石墨烯对于创面愈合作用影响不大，对于创面VEGF表达没有影响。

关键词：氧化石墨烯;VEGF;液体创可贴

【中图分类号】 R943 【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）08--03

Abstract：Low-concentration graphene oxide （GO） was used as the antibacterial component of a new type of liquid band-aid with PVA-124 as film-forming matrix.Test optimal bacteriostatic concentrations and effects on VEGF expression and wound healing in rats.The results showed that the GO content of 120 mg/mL had a better effect on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa.Graphene oxide has little effect on wound healing and no effect on VEGF expression in wound.

前言：

涂膜剂是一种涂抹于创面或患处后形成一层保护膜的外用液体制剂，基本原理是将药物溶解或分散在含有成膜材料的溶剂中，液体创可贴是涂膜剂的一种，其主要是用于皮肤表面创伤，涂抹于创伤皮肤表面能快速形成完整而无气泡、防水、防渗且具有一定的柔韧性和透气性的保护薄膜，其能保护创面免受细菌的感染、异物入侵、避免与衣物的再擦伤等功能，虽然目前已经有大量用于皮肤创面的涂膜剂上市，相较于传统的敷料定的优势，但对于伤口感染防治效果欠佳，不利于伤口愈合。PVA[1] [2]是涂膜剂中常用的成膜材料，是唯一能够被微生物降解的高分子材料，具有较佳的生物相容性。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物之一，结构与石墨烯基本相同，在单层碳原子结构的基面上含有丰富的含氧基团[3]。丰富含氧官能团的引入使得原来石墨烯所拥有的非常独特优异的光、电、磁、等物理和化學性质大大降低，但增强了氧化石墨烯的反应活性和亲水性，因此为其自身带来了广泛的应用前景。2010年中黄庆林[3]课题组首次提出氧化石墨烯抑菌作用，其抗菌原理仍未明确，Liwei Hui[4]提出盐水中氧化石墨烯为200 μg/ mL时产生<1%的细菌存活率，从众多报道中其可能存在的抗菌原理可简单总结为物理破坏理论、氧化应激理论、磷脂分子抽提破坏理论三个方面[5]，基于GO良好的生物相容性，有研究表明高浓度氧化石墨烯会对哺乳动物细胞产生毒性，具有显著遗传毒性特性并导致严重的DNA损伤[6-10]，VEGF（血管生长内皮生长因子）在创面愈合早期能促进创面新生血管的形成为创面愈合提供营养物质[11-13]。

1仪器与试剂

1.1实验仪器

XSR205DU型分析天平（Mettler-Toledo Gmbh）、TSJ-Ⅱ型脱水机（常州市中威电子仪器有限公司）、BMJ-Ⅲ型包埋（常州郊区中威电子仪器厂）、RM2016型切片机（上海徕卡仪器有限公司）、BA410型显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）、BMJ-A型冷冻台（常州市中盛电子仪器有限公司）、PHY-Ⅲ型漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公）、DHG-9148A型干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、A80400011型修复仪（Thermo Shandon Limited ）、HY-5型脱色摇床（上海程捷仪器设备有限公司）、XK80-A型漩涡混匀仪（江苏新康医疗器械有限公司）、S1010E型掌上离心机（美国SCLOGEX）、超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂SW-CJ-2F）、恒温培养箱（天呈TS-100B）、YE3K176096型20-200 μl移液枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司，）HWS-28型数显恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）、

1.2试剂：

氧化石墨烯（苏州碳丰科技）、PVA124（国药集团化学试剂有限公司，批号：20190703）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20190605）、甘油（国药集团化学试剂有限公司，批号：20130105）、LB琼脂培养基（上海博微生物科技有限公司，批号：20200802）、80%苯扎氯铵（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10238825）、4%多聚甲醛通用型组织固定液（biosharp，批号：69120900）、氯化钠注射液（贵州科伦药业有限公司，批号：D21010705），CMCC（B）10104铜绿假单胞菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、CMCC（B）26003金黄色葡萄球菌均购自上海鲁微科技有限公司、9cm细菌培养皿（biosharp BS-90D，批号：200518）

1.3实验动物

实验动物SPF级SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。实验大鼠于SPF级动物实验房饲养，饲养环境12 h明暗交替，温度（22 ± 2）℃，相对湿度（50 ± 10）%

2、方法

2.1氧化石墨烯（GO）液体创可贴制备工艺

按处方量用分析天平称取PVA124并用10倍量的水溶胀2 h后，90℃水浴边搅拌边加热使其完全溶解后静止放冷后，按处方量加入甘油、苯扎氯铵（含量为0.017%）、和无水乙醇搅拌均匀后再加入一定量氧化石墨烯（GO）水溶液（2 mg/mL），之后用纯水定容至100 ml。

2.2 不同浓度氧化石墨烯（GO）液体创可贴制备

按2.1制法制备出氧化石墨烯（GO）含量分别为50、85、120、155、190微克每毫升的液体创可贴。

2.3不同浓度氧化石墨烯液体创可贴抑菌

用接种环分别挑取金黄色葡萄球、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌菌落置于装有生理盐水的灭菌是试管中作为菌原液，按麦氏比浊法制备3×108 cfu/ml菌悬液。用移液枪吸取100微升菌悬液涂布于LB琼脂培养基上后将分别浸泡在不同浓度液体创可贴10 min的7 mm药敏试纸表面多余的液体除净后将药敏试纸轻轻放置于培养基表面后将培养皿置于37摄氏度培养箱中培养24小时后观察抑菌圈大小。

2.4 氧化石墨烯（GO）液体创可贴对创面愈合的影响

2.4.1 SD大鼠全层皮肤缺损模型的造模：

随机选15只体重在250 g[14] [15]左右的SD雄性大鼠适应性喂养1周后观察健康状况等良好后随机分成5组，每组3只，一组为空白组（只除毛不涂药），其余组按天数分组;大鼠在造模前禁食禁水8 h，称重后，腹腔注射10 %水合氯醛按0.3 mg/100 g麻醉除去大鼠脊柱两侧的鼠毛（两侧除毛面积为0.6×0.6 cm），在除毛处使用酒精消毒后（使用眼科剪按标记剪出皮肤全层0.6×0.6 cm左右进行皮肤全切（真皮）给药示意图如图1：

2.4.2 檢测指标取样

大鼠造模后，分别于造模后第3、7、10、14天随机挑选一组老鼠脱颈处死后用薄膜在伤口处描绘伤口面积后取伤口组织用4%多聚甲醛固定液固定。

2.4.3 创面愈合率计算

大鼠真皮皮肤全切后使用薄膜在伤口处描绘伤口面积后用质地均匀的纸板剪出相应的面积大小后用分析天平称量后换算面积大小;愈合率 = （ 原创面面积 - 第n天创面面积） /原创面面积× 100% 。

2.4.4 VEGF（大鼠血管内表皮生长因子）阳性细胞数统计

固定后的组织经常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋、切片后采用免疫组化法染色后对每张切片进行 VEGF 检测，本次免疫组化均由专业的病理医师使用显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再分别采集200倍显微图像，共采集3张，Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比（% DAB Positive Tissue）。

3、实验结果与分析

统计分析采用SPSS23.0统计分析软件。采用均数±标准差表示; 多组间计量资料比较符合正态分布采用单因素设计方差分析，多组间计量资料比较不符合正态分布采用非参数检验Kruskal-Wallis H法。P<0.05为差异有统计学意义。

3.1各不同浓度液体创可贴抑菌情况

表1：液体创可贴可知含有石墨烯（GO）的液体创可贴抑菌强度较没有氧化石墨烯（GO）抑菌效果好，含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液体创可贴抑大肠埃希氏菌菌和铜绿假单胞菌效果较其他浓度好，通过与基质组的对比发现氧化石墨烯对铜绿假单胞菌有一定的抑菌作用。含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液体创可贴综合评分较高，后以含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液体创可贴做创面愈合实验。

3.2创面面积及愈合率

第10天和第14天愈合率为严重偏态分布因此采用非参数检验。结果表示不同时间各组之间愈合率比较无显著差异P>0.05。

3.3创面组织VEGF阳性占比

由表3分析知GO组和曼敦组在第三天时VEGF的表达较基质组和生理盐水组强，通过GO组与基质组的比较，GO组早期对于创面VEGF的表达有一定的影响，可能在早期促进VEGF的表达，在第三天时各组VEGF表达强度较强，在第三天之后各组VEGF表达均呈减少趋势。

讨论

低浓度的氧化石墨烯（GO）有抑菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌）作用，抑金黄色葡萄球菌的作用较强，大肠埃希氏菌次之，对于铜绿假单胞菌的抑菌作用较弱，但较含0.017%苯扎氯铵佳。低浓度氧化石墨烯（GO）对于创面愈合的促进作用不大，但在创面愈合初期使用氧化石墨烯液体创可贴时其VEGF表达较生理盐水处理的创面高的原因可能是其成膜后对创面起到保护作用并且其抑制细菌繁殖，预防创伤感染，因此在创伤初期对于VEGF的表达可能有促进作用。

GO 是一种优质的新型材料，在众多领域中运用广泛，随着GO的广泛应用，其表现出对生态环境、生物遗传等方面存在一定风险。根据有关报道GO 具有生态毒性[16] [17]，通过机械损伤、氧化应激等影响动植物细胞调控，产生病理毒性和遗传毒性，对小鼠肝脏、脾肺产生浓度依赖性的不同程度的毒性[18] [19]，对于GO在医疗领域的使用应确保其对人体无害，不产生遗传毒性以及生殖毒性，规范GO的用量。本研究利用含氧化石墨烯190 μg/mL的液体创可贴进行抗菌测试，190 μg/mL的液体创可贴均有抑金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌作用，氧化石墨烯抑革兰氏阳性菌强于革兰氏阴性菌，其中120 μg/mL综合抑菌作用较佳。对创面的愈合无促进作用。戴清仪公开发表的专利中提到含0.5 mg/mL以及2 mg/mL氧化石墨烯液体创可贴均能促进创面愈合，但2 mg/mL对细胞产生一定毒性，李龙剑公开发表的芦荟苷氧化石墨烯凝肢的制备及其对创伤修复作用的研究提到其凝胶中含有0.125 μg/mL产生一定的抑菌效果，使芦荟苷更能促进创面愈合。

[项目基金]：2020年大学生创业创新训练项目，项目编号：202010600010

作者简介：韦晓（2000年-），广西中医药大学制药工程专业，在读本科。

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