豆佳媛，田巍，唐琴，逯莉，周艳红

（陕西国际商贸学院，陕西 西安 712046）

1 前言

野菊花为菊科野菊（Chrysanthemum indicum L.）干燥的头状花序，可以入药和泡茶饮用[1]。具有散风热、抗消炎和消肿解毒等药效，主治风热感冒、咽喉肿痛等[2]，对治疗心血管、肿瘤、抗病毒等也有良好的作用[3]。野菊花自然资源丰富且在我国大量分布，其药用价值早为民间广泛流传，具有良好的市场开发价值。野菊花主要含有黄酮类、挥发油和萜类、多糖类化学成分，其中对于黄酮类化合物越来越多学者进行相关研究[4]。目前，我国对黄酮类化合物的开发已经成为热点，但野菊花中的黄酮含量提取方法单一，结果不太理想。近年来，超声波辅助法提取效果较好，且适宜药品的大量生产从而被广泛运用[5]。本文通过阅读相关文献，总结出超声波辅助法提取野菊花药材中总黄酮的提取工艺，并以黄酮含量为研究指标，利用响应面分析进一步优化其提取工艺，为中药野菊花的资源开发和利用提供可靠的理论依据。

2 实验部分

2.1 实验材料

2.1.1 材料及试剂

芦丁标准品，北京恒元启天化工技术研究所；野菊花，北京同仁堂咸阳店；乙醇，国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠，天津市天力化学试剂有限公司；氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；九水硝酸铝，天津市天力化学试剂有限公司；所用到的水均为超纯水。

2.1.2 仪器与设备

中药粉碎机，JZL，四川巨子超微科技有限公司；紫外分光光度仪，UV-6000PC，上海元析仪器有限公司；超声波清洗器，KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅，SK-3005A，北京市永光明医疗仪器有限公司；电子天平，AG135，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；超纯水器，YS-10A型，上海摩科科技集团；移液枪，SW2-45，上海元析仪器有限公司；旋蒸仪，JSE-679，上海摩科科技集团；真空泵，GF-987，上海摩科科技集团；离心机，TD5A-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司；震荡仪，SHZ-82，江苏丹阳门科教仪器厂。

2.2 试验步骤

2.2.1 野菊花提取总黄酮的工艺流程

野菊花→筛选→烘干→粉碎→称量→超声提取→真空浓缩→离心→得黄酮粗提液

2.2.2 芦丁标准品母液的配制

称取芦丁标准品25 mg，在60℃下干燥至恒重，转移至25 mL容量瓶中并用30%乙醇溶液定容，震荡混匀即配制成为1 mg·mL-1的芦丁标准品溶液，备用。

2.2.3 芦丁标准曲线的绘制

用移液枪分别移取2.2.2项下配置好的芦丁标准品母液0到10 mL于25 mL已经加入2.5 mL 5%亚硝酸钠溶液的棕色容量瓶中，利用震荡仪器充分震荡摇匀，再分别加入2.5 mL 10%的Al（NO3）3·9H2O水溶液，利用震荡仪器充分震荡摇匀，最后分别加入10 mL 4%的NaOH溶液，用体积分数为30%的乙醇溶液定容，充分混合，静置，备用。

将加入芦丁标准品母液0 ml的溶液放至比色杯中作为参比溶液，利用紫外分光光度计在波长为510 nm处测定各浓度标准品吸光度并建立芦丁标准曲线。

2.2.4 野菊花中总黄酮量的计算

利用万分之一天平精密称取2.00 g野菊花药材粉末，按2.2.1项下方法进行野菊花药材中总黄酮的提取，用5 mL移液管精确吸取4 mL粗提液，采用2.2.3项下方法显色测定野菊花中总黄酮粗提溶液的吸光度，根据下式计算野菊花药材中总黄酮的含量：

式中：A为根据标准曲线得到的供试品溶液的浓度（mg·mL-1），F1为提取时定容体积(mL)，F2为显色反应时定容体积(mL)，M为野菊花药材质量(g)，F3为显色反应时取样体积(mL)。

2.2.5 单因素实验设计

(1)提取液浓度对野菊花总黄酮得率影响

用取样匙取野菊花药材粉末，用万分之一天平精密称定，2 g/份，共18份，置于锥形瓶中，随机分为6组，每组三个平行，分别加入20%～100%浓度的乙醇溶液，各组按提取溶剂与野菊花药材液料比50∶1（mL/g）混和后，用超声仪超声提取45 min，设置提取功率为480 W，提取温度为25℃，再按2.2.4项下方法进行样品含量测定，选出生产工艺中最适宜的乙醇浓度。

(2)超声提取时间对野菊花总黄酮得率影响

用取样匙取野菊花药材粉末，用万分之一天平精密称定，2 g/份，共18份，置于锥形瓶中，随机分为6组，每组三个平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶剂与野菊花药材液料比50∶1（mL/g）混和后，在超声仪上分别设置提取时间为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，提取功率为480 W，提取温度为25℃，再按2.2.4样品含量测定方法操作，计算不同提取时间下野菊花总黄酮提取的含量，分析提取时间对野菊花药材总黄酮的提取效果，选出生产工艺中最适宜的提取时间。

(3)液料比对野菊花总黄酮得率影响

用取样匙取野菊花药材粉末，用万分之一天平精密称定，2 g/份，共18份，置于锥形瓶中，随机分为6组，每组三个平行，再分别按提取溶剂与野菊花药材粉末的液料比10∶1(v∶v)、20∶1(v∶v)、30∶1(v∶v)、40∶1(v∶v)、50∶1(v∶v)、60∶1(v∶v)混和后，加入浓度为60%的乙醇，用超声仪超声提取45 min，提取功率设置为480 W，提取温度设置为25℃，再按2.2.4样品含量测定方法操作，计算不同料液比下野菊花总黄酮提取的含量，分析料液比对野菊花药材总黄酮的提取效果，选出生产工艺中最适宜的液料比。

(4)提取功率对野菊花总黄酮得率影响

用取样匙取野菊花药材粉末，用万分之一天平精密称定，2 g/份，共18份，置于锥形瓶中，随机分为6组，每组三个平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶剂与野菊花药材液料比50∶1（mL/g）混和后，在超声仪上分别设置提取功率为80 W、180 W、280 W、380 W、480 W、580 W，提取时间45 min，提取温度25℃，再按2.2.4样品含量测定方法操作，计算不同提取功率下野菊花总黄酮提取的含量，分析提取功率对野菊花药材总黄酮的提取效果，选出生产工艺中最适宜的提取功率。

(5)提取温度对野菊花总黄酮得率影响

用取样匙取野菊花药材粉末，用万分之一天平精密称定，2 g/份，共18份，置于锥形瓶中，随机分为6组，每组三个平行，加入60%的乙醇溶液，再按照提取溶剂与野菊花药材液料比50∶1（mL/g）混合后，在超声仪上分别设置提取温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，提取时间为45 min，提取功率为480 W，再按2.2.4样品含量测定方法操作，计算不同提取温度下野菊花总黄酮提取的含量，分析提取温度对野菊花药材总黄酮的提取效果，选出最适提取温度。

2.2.6 响应面设计

根据2.2.5项下的试验结果和响应面分析的试验设计方法，以野菊花药材中的总黄酮含量为响应值，乙醇溶液浓度、液料比、时间、温度以及功率这五项因素为响应变量进行响应面分析试验，优化超声波辅助法提取野菊花药材中总黄酮工艺的参数。

2.2.7 数据分析

实验数据先采用Excle2013进行预处理，再用Design Expert 8.06进行相关分析。

2.3 实验结果

2.3.1 芦丁标准曲线

下图的横坐标为芦丁标准品的质量浓度C(mg·mL-1)，纵坐标为芦丁标准品各质量浓度下的吸光度A，芦丁标准曲线的回归方程为y=1.467x+0.0181，其R2=0.9991。

图1 芦丁标准曲线图

2.3.2 单因素分析结果

(1)野菊花提取液中总黄酮含量对乙醇浓度的响应

如图2所示，当乙醇溶液浓度从20%增加到40%时，野菊花药材提取液中总黄酮的含量与乙醇溶液浓度呈显著正相关，当乙醇体积分数为40%时，野菊花药材提取液中总黄酮的样品含量达最大值为44.31 mg/g；但随着乙醇浓度的继续上升，野菊花药材总黄酮的含量逐渐呈下降趋势，这可能与提取液浓度太高，部分极性略小的黄酮无法提取出有关。因此提取野菊花中总黄酮时选择最佳乙醇提取液浓度为40%。

图2 野菊花总黄酮含量对乙醇浓度的响应

(2)野菊花提取液中总黄酮含量对液料比的响应

如图3所示，当提取溶剂与原药材的液料比从10∶1（mL/g）到60∶1（mL/g）时，野菊花药材总黄酮的含量逐渐升高，这可能是乙醇提取液浓度越高，溶剂中相应的野菊花总黄酮含量浓度越低，超声频率推动力越大，使提取速率增加，使野菊花药材总黄酮提取率增大，在提取溶剂与原药材的液料比为50∶1（mL/g）时提取溶液中总黄酮含量42.69 mg/g，达到最高；当液料比继续增大时，野菊花药材总黄酮的含量逐渐呈现下降的趋势，可能是野菊花药材中其他物质的溶出率增加，影响了样品中总黄酮的溶出率。因此提取野菊花中总黄酮时选择最佳液料比为50∶1（mL/g）。

图3 野菊花总黄酮含量对提取液料比的响应

(3)野菊花提取液中总黄酮含量对时间的响应

如图4所示，超声仪超声提取时间从15 min到60 min时，野菊花提取液中总黄酮含量与提取时间呈正相关，在提取时间为60 min时样品中总黄酮的含量达最高点41.62 mg/g；随提取时间的继续推移，野菊花药材总黄酮含量反而下降，这可能与提取时间太长，部分黄酮结构与空气中某些物质发生反应，导致部分结构破坏或者降解。

图4 野菊花总黄酮含量对时间的响应

(4)野菊花提取液中总黄酮含量对温度的响应

由图5可知，超声温度从20℃加热上升到35℃时，野菊花提取液中总黄酮含量与提取温度呈正相关，当提取温度达到35℃时样品中总黄酮的含量能达到最高点，为43.71 mg/g，因此提取野菊花中总黄酮时选择最佳提取温度为35℃。

图5 野菊花总黄酮含量对温度的响应

(5)野菊花提取液中总黄酮含量对超声提取功率的响应

由图6可知，随着超声提取功率的上升，野菊花药材中总黄酮的含量呈先逐渐上升后下降的趋势，在提取功率为480 W时总黄酮的含量达到最高，为46.54 mg/g。可能是黄酮在野菊花药材中与其他成分已达成某种平衡状态，当超声功率增强时，药材中总黄酮快速溶出，使得提取率加大，当超声波功率大于580 W时大部分存在于待测样品的微小含量成分与其他杂质随着超声频率的增强一起析出，使得某种平衡被打破，样品中黄酮结构遭到破坏，导致野菊花药材中总黄酮提取量下降。因此提取野菊花中总黄酮时选择最佳提取功率为480 W。

图6 野菊花总黄酮含量对超声功率的响应

2.3.3 野菊花总黄酮提取工艺优化

在前期2.3.2项下单因素试验结果的基础上，依据分析软件Design-Expert 8.0.6中的试验设计原理，分别以提取溶液的浓度、提取溶液与原药材的液料比、所用时间、温度以及所用功率为响应变量，野菊花药材提取液中总黄酮含量为响应值，进行数据拟合优化超声波辅助法提取野菊花药材中总黄酮工艺的参数，设计因素水平表见表1，结果见表2、表3。

表1 野菊花总黄酮提取响应面设计因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计与结果

表3 回归方程方差分析

续表2

由图7a可知，料液比的坡面相比于提取浓度的坡面更为陡峭，变化幅度更大，可以看出，料液比对提取率的影响更大；由图7b可知，提取浓度和提取时间坡面非常接近，二者对提取率的影响相差不大；由图7c可知，提取温度的坡面相比于提取浓度的坡面略微陡峭，提取温度对提取率的影响略大一些；由图7d可知，提取功率的坡面相比于提取浓度的坡面更为陡峭，变化幅度更大，可以看出，提取功率对提取率的影响更大；由图7e可知，料液比的坡面相比于提取时间的坡面更为陡峭，变化幅度更大，可以看出，料液比对提取率的影响更大；由图7f可知，温度和料液比的响应面曲线斜率相近，二者影响相差不大，但可看出料液比比温度影响相对显著一些；由图7g可知，从3D响应面曲线的峰值及坡度可以看出，提取功率与料液比的影响程度相差不大，但功率对黄酮提取率的影响比料液比相对更显著一些；由图7h可知，提取温度与提取时间的影响程度相差不大，但温度对黄酮提取率的影响相对更显著一些；由图7i可知，提取功率与提取时间之间的相互作用不太明显，轮廓线更集中在提取功率一侧，而功率方向响应面曲线在3D响应中的斜率略大于提取时间方向，因此，超声功率对提取率的影响略大于提取时间；由图7j可知，提取功率和提取温度坡面非常接近，二者对提取率的影响相差不大。结合表3和图7，可以看出，野菊花总黄酮提取率的影响因素大小依次为：提取功率>液料比>提取温度>提取时间>提取浓度。

图7 各因素及其交互作用对提取率的影响

以前期试验结果为基础，利用响应面分析软件，采用Box-Behnken原理进行实验的拟合与分析发现，超声辅助法提野菊花药材中总黄酮得率的模型：

由响应面分析软件Design-Expert 8.0.6分析得出最佳生产条件为：乙醇体积分数为39.89%，乙醇溶液与野菊花药材的液料比为50.61∶1（mL/g），提取时间59.83 min、提取温度35.17℃、提取功率478.06 W（见图7）。结合现实生产中的可行性，调整最佳适宜工艺为：乙醇浓度40%、乙醇溶液与野菊花药材的液料比51∶1（mL/g）、超声提取功率478 W、超声提取时间60 min、超声提取温度35℃。在该优化后的条件下进行多次实验的验证，所得野菊花药材提取液中总黄酮含量平均值为45.13 mg/g，与预测值45.397 mg/g极为接近，说明对野菊花药材总黄酮提取工艺条件参数的优化可靠，与实际情况符合度高，具有较好的实操以及商业应用价值。

3 结论

（1）在单因素试验设计下，对比分析乙醇提取液浓度、液料比、温度、时间和功率对野菊花药材中总黄酮提取含量的效应，结果发现：时间为60 min、温度为35℃、功率为480 W、乙醇浓度40%、液料比在50∶1（mL/g）时野菊花药材中总黄酮提取效果最好。

（2）以前期试验结果为基础，利用响应面分析软件，采用Box-Behnken原理进行实验的拟合与分析发现，结合超声辅助法提野菊花药材中总黄酮得率的模型经回归计算，提取时间在59.83 min、提取温度为35.17℃、提取功率为478.06 W、乙醇浓度39.89%、液料比在50.61∶1（mL/g）时提取野菊花药材中总黄酮量可达最高。