赵嘉琳 窦志芳 赵 琼

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)又名震颤麻痹(Paralysis agitans),作为临床常见的中枢神经系统退行性疾病,症状多见运动障碍、静止性震颤、姿势平衡障碍等[1]。本病发病年龄多集中于60岁及以上[2]，中国65岁以上患病率约达1.7%，由于社会老龄化问题日趋严重，患病率仍有提升[3]。临床治疗中PD多使用左旋多巴为主要成分的药物制剂，但局限于对症治疗,且长期使用该类药物患者易产生不良作用[4]。地黄饮子临床用以治疗下元虚衰、阴阳俱虚的喑痱证，组方药物有熟地黄、山萸肉、肉苁蓉等，具有肾阴阳双补的功效。国家名老中医韩明向教授，在治疗PD的临床用药中以地黄饮子方为基础，以滋补肝肾作为主要治疗方向，并辨证论治效如桴鼓[5]，伍爱国[6]在黄煌教授“方人”理论指导下，明确指出，临床中地黄饮子用药后可明显改善精神情态，长期坚持可改善行走质量。肾为先天之本，虚则气滞，气停则血瘀。多研究表明[7]PD不同证候均可伴有瘀血的存在。赵冠英和杨明会教授认为，肾虚血瘀为PD的基本病机，补肾活血法临床治疗屡获奇效[8]。已有实验证明，丹皮酚作为牡丹皮的活性成分，能够对PD模型细胞损伤进行保护[9]。因此，此研究以“肾脑相关”“肾虚血瘀”为理论指导，使用长期低剂量腹腔注射D-半乳糖结合颈背部皮下注射鱼藤酮溶液复合式方法制备PD病证结合模型，选用地黄饮子加活血化瘀药牡丹皮进行干预，研究地黄饮子加减方对PD大鼠黑质纹状体内α-syn的影响，探讨地黄饮子加减方对肾虚血瘀证PD大鼠治疗中的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠80只，体质量(230±20)g，6个月龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号：SCXF(京)2018-0003)。将实验动物饲养于山西省中医药大学实验动物房，自由饮食，自然光源，室温(25±2)℃。为保证大鼠存活率，进行适应性喂养1周。

1.2 主要试剂D-半乳糖(北京索莱宝科技有限公司，D8310-100 g)，鱼藤酮(罗恩，R006873)，DMSO(Solarbio,D8370-100 g)，α-synuclein 抗体(武汉三鹰，66412-1-Ig)，HPR标记山羊抗小鼠二抗(武汉赛维尔，G1216-3)，高脂饲料(特洛菲饲料科技有限公司)，地黄饮子加减方(熟地黄、巴戟天、山萸肉、石斛、肉苁蓉、炮附片、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志、薄荷、牡丹皮)购置于北京同仁堂，经山西中医药大学赵琼副教授鉴定为正品。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组将80只大鼠据Rand函数，随机分为PDZC组、PDJB组、SXYY组、DHYZ组,每组20只。PDZC组喂养基础饲料，其余各组大鼠喂养高脂饲料。

1.3.2 病症结合PD大鼠模型建立PD模型构建：除PDZC组大鼠，余下组行颈背部皮下注射鱼藤酮法造PD模型[11]。每日早9：00，在PDJB、SXXY、DHYZ组大鼠颈背部皮下注射浓度为1.0 mg/(kg·d)的鱼藤酮溶液(DMSO为溶剂：1.5 mg/ml)。前3周注射1/2正常水平的鱼藤酮溶液，以降低大鼠病死率。3周后恢复正常水平注射。每周休息1 d。PDZC组用同样方法注入等体积生理盐水。肾虚血瘀证模型构建：SXYY、DHYZ组大鼠连续腹腔注射D-gal溶液(D-gal粉末50 mg/(kg·d)溶于0.9%生理盐水)6周。其余各组大鼠用同样方法注入等体积生理盐水。

1.3.3 药物制备及给药地黄饮子加减方：药物浸泡后，反复2次煎煮浓缩成178%的混悬液，最终每剂药浓缩成55.6 ml，每毫升含生药1.78 g，经高压灭菌后放进冰箱4 ℃冷藏备用。

给药方法：在病证结合造模第3周予DHYZ组灌胃给药，依据大鼠与人体的体表面积折算等效比率计量表，算出大鼠等效剂量为1 ml/100 g/d。其余各组大鼠用同样方法注入等体积生理盐水。每天给药，每天1次，连续4周。

1.3.4 行为学测试一般行为学观察：观察各组大鼠外观形态、行动反应能力等。依以下标准划分等级类别[12]：1分：拘捕表现变弱、毛发脏黄可见、弓背抬高及自主活动稍减少；2分：1分的基础上，大鼠自主活动弱化、行为缓慢且平衡力减弱；4分：2分基础上，平衡力明显变差，甚则无法直线行走，前进时或有呈一侧偏转倾向；6分：4分基础上，大鼠呈卧向单侧姿态行步，瘫软、较少主动前进行为、进食减少；8分：6分基础上，大鼠体态卧向一侧、无法行进、进食停止；10分：综合以上，大鼠表现有瘫痪、体质量降低明显，生命体征弱或已死亡状态。行为学评分3分及以上考虑为造模成功。

悬挂实验：根据KURIBARA实验说明，制作悬挂仪器[10]。用直径为1.5 mm的铁丝，水平固定于支架两端。支架左右距离间隔15 cm，离地面高度为20 cm。悬挂丝下放置敷料垫，防止大鼠坠落造成伤害。观察大鼠两前肢稳定抓握铁丝，开始计时记录大鼠悬挂时间。悬挂8 s及以上双足记5分，单足记4分；悬挂5 s及以上双足记3分，单足记2分；悬挂不足1 s记0分。其余记1分。

1.3.5 待测样品制备及测定大脑标本采集:行为学检测完毕。使用Rand函数，每组选择5只大鼠行开胸心脏灌注术，使用复合麻药(水合氯醛、乌来糖5∶1的比例，溶于30 g生理盐水)以4.5 ml/kg标准进行腹腔注射麻醉各组大鼠。观察大鼠深度麻醉后，在大鼠左心室处插入注射针头，剪开右心耳注射灌注0.9%生理盐水。行进过程中观察肝脏发白后，改换4%多聚甲醛液进行固定灌注，直至触摸大鼠颈部、尾部完全僵硬。灌注后迅速取出脑组织，在4%多聚甲醛液重固定1周以上，全部进行石蜡切片处理。

黑质纹状体采集：大鼠麻醉后迅速断头取脑，放置于冰上进行黑质、纹状体组织分离术。剥离组织分装于标号冻存管后移至液氮罐内，结束后一并放-80 ℃冰箱冷冻保存。

α-syn免疫组化检测：将石蜡切片依次置于不同浓度二甲苯及乙醇溶液内，蒸馏水洗至脱蜡。在盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)中放入切片，高温下条件下进行抗原修复，自然冷却后置玻片于PBS试剂液体中洗涤3次，每次5 min。洗涤后在3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min，放置于PBS中洗涤3次，每次5 min。洗涤后的切片组化圈内滴加3%BSA溶液，室温下封闭30 min。滴加PBS及一抗，放入4 ℃孵育过夜。取出切片后使用PBS溶液洗涤3次，每次5 min。组化圈内滴加相对种属的HRP标记物，室温下孵育50 min。置于PBS溶液中洗涤3次，每次5 min。稍风干后加DAB显色液，显微镜下观察实验结果，阳性为棕黄色。显色结束后自来水冲洗切片。用苏木素复染后自来水冲洗。等待切片自然干燥后，使用中性树胶封片。每组内使用Rand函数随机选取5个组织，每组织每张切片拍出至少3个200 X照片，应用IPP 6.0软件进行光密度分析，计算3张照片的平均光密度值。

2 结果

2.1 一般情况实验过程中PDZC、PDJB、SXYY组大鼠存活率为100%，DHYZ组因鱼藤酮毒性致死2只，操作失误致死2只。

观察各组大鼠造模情况可得，PDZC组大鼠形态正常，毛色干净洁白，且活动反应灵敏，体质量稳定增长。PDJB组第7天左右进食减缓，呈现弓背姿势，毛色发黄变脏。SXXY组皮毛脏黄，重心降低，且捕捉抵抗力明显变弱，自洁能力明显变差。DHYZ组较SXXY组有所改善，具备基本自洁能力，且拘捕具有明显抵抗，毛色趋于PDZC组。

2.2 体质量变化相比较前3周各组大鼠造模过程体质量变化。与PDZC组比较，PDJB、SXXY、DHYZ组体质量增长明显延缓，SXXY组与PDZC组比较体质量，差异具有统计学意义(P<0.05)；DHYZ组相较SXXY组体质量改善，差异具有统计学意义(P<0.01)。说明地黄饮子加减方可显著提高PD大鼠生存质量。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化比较

2.3 行为学评分结果根据行为学评分标准，观察记录各组大鼠实验后行为学表现。与PDZC组比较，PDJB、SXXY、DHYZ组分数差异明显。SXXY组较PDZC组分数增高，差异具有统计学意义(P<0.05)；DHYZ组较SXXY组分数明显降低，差异具有明显统计学意义(P<0.01)。说明地黄饮子加减方可使PD大鼠异常行为得到修正，提升大鼠生活状态。见表2。

表2 各组大鼠行为学检测评分结果比较(分，

2.4 悬挂实验测试结果基于悬挂评分高低考察大鼠身体肌力及协调能力，高分代表大鼠四肢肌力及协调能力正常，低分反之。根据表3结果示，与PDZC组相比，PDJB、SXXY、DHYZ组悬挂实验得分低，差异具有统计学意义(P<0.05)。DHYZ组相较SXXY组实验得分高，差异具有明显统计学意义(P<0.01)说明SXXY组四肢肌力减退，协调能力差，DHYZ组肢体肌力有所恢复，协调能力良好。

表3 各组大鼠悬挂实验评分结果比较 (分，

2.5 各组大鼠免疫组化结果以PDZC组实验大鼠为参考，SXXY组黑质纹状体内α-syn平均光密度值升高，差异有统计学意义(P<0.05)；以SXYY组实验大鼠作为参考，DHYZ组大鼠黑质纹状体内α-syn平均光密度值降低差异有显著统计学意义(P<0.01)。说明对比PDZC组，SXXY组大鼠黑质及纹状体中α-syn含量增多。DHYZ组对比SXXY组大鼠黑质纹状体内α-syn含量有所控制，证明地黄饮子方加减可有效控制α-syn含量。

注：与PDZC组比较，**P<0.01;与SXXY组比较，##P<0.01。

4组大鼠中脑黑质纹状体内α-syn免疫组织化学染色检测结果如图2、图3所示，PDZC组内大鼠黑质纹状体中胞体清晰完整，未见明显棕褐色核团(α-syn阳性表达)，PDJB组内大鼠黑质纹状体中可见明显棕褐色核团群体，SXXU组内大鼠黑质纹状体内细胞明显减少，且棕褐色核团表达明显。DHYZ组内大鼠黑质纹状体体内虽见细胞核明显偏移，但细胞数量有所恢复，且棕褐色表达减弱，α-syn表达不明显。

图2 各组大鼠黑质内α-syn免疫组化比较

图3 各组大鼠纹状体内α-syn免疫组化比较

3 讨论

PD为老年病多发性疾病之一，中医讨论归为“颤证” “颤震”“痴呆”“痉证”等范畴，认为其病位为脑。中医藏象肾脑系统理论认为，肾藏精，精生髓，髓聚为脑，脑为髓海[11]。脑是主司感觉运动的器官，张锡纯明确指出：“人之脑髓空者……甚或猝然昏厥，知觉运动俱废”。脑髓空虚是运动障碍发生的根本原因。肾精作为脑髓生化之源，异常可导致脑生理功能失常，在老年人多见运动障碍、姿态不稳等。生理上，肾作为先天之本，其物质基础及功能作用，随人体的生、长、壮、老自然消耗。肾中阴精化生和阳气温煦作为各脏腑维持生理功能及精血津液的重要保证，一旦亏损则脏气推动无力，化气无源，导致阴血亏少，机体脏腑失去濡养。气机升降乖张，血液运行受到影响，导致脉道阻塞形成血瘀。病理上，外感六淫、饮食劳倦、时行疫毒等均可直接或间接损及肾脏，从而导致气不运血，停积为血瘀。PD好发于高龄人群，中医讨论PD病机总属本虚标实，从生理与病理分析均可导致肾虚血瘀证的发生，其中肾虚为本，血瘀为标[12]。肾虚血瘀证作为老年病患者的特征[13]，已被李军艳等[14]证实为PD的基本病机。临床上治疗多使用地黄饮子组方进行干预治疗[15]。地黄饮子最早为唐代的补肾方，宋代以后逐渐作为治疗中风后肾虚专用方，《黄帝素问宣明论方》记载：“内夺而厥，舌喑不能言，二足废不为用。肾脉虚弱，其气厥不至，舌不仁”。此组方中药物熟地黄、山萸肉以补肾阴，肉苁蓉、巴戟天共壮肾阳；附片、肉桂、石斛、麦冬、五味子有温阳固元，引火下行，滋肺肾的功效。前期研究发现,地黄饮子方可以“肾”为靶点[16]。此实验在地黄饮子方的基础上加用牡丹皮，补肾同时兼备活血的作用。探讨地黄饮子加减方对PD肾虚血瘀证的作用机制，以期为改善临床治疗方案提供实验基础，达到对症治疗、早期干预的目的，具有十分重要的临床价值和社会意义。

现代医学表明PD发病机制复杂多变，可能受异常蛋白聚集、氧化应激及神经炎症等影响。其诊断金标准为PD患者大脑黑质、纹状体神经元胞体内路易小体(Lewy bodies, LBs)的存在。而α-syn作为LBs的重要组成，虽还未明确其与PD的关系。但多学者表明，α-syn的异常聚集是PD发病的重点。α-syn通过病理反应后形成的聚集体能够引起多巴胺能神经元死亡，进一步导致PD产生运动症状[17]。目前中医药对PD作用机制多围绕氧化应激展开，对异常蛋白聚集较少涉及[18]。综上所述，PD作为一类临床发病率极高的老年性神经系统疾病，是多种致病机制复杂交错最终导致α-syn聚集LBs的形成，而地黄饮子加减方能够抑制黑质多巴胺能神经元损伤[12]，对α-syn含量是否有影响仍待探究。

研究使用颈背部皮下注射鱼藤酮溶液方法制备PD大鼠模型，并于此基础上复合制备肾虚血瘀证PD大鼠模型，实验大鼠出现弓背向上、运动迟缓等PD行为学表现。PD肾虚血瘀证患者临床表现不仅表现为步态失衡或震颤，常有多种行为学共存，如病患四肢肌张力升高，运动能力失常所导致的肌肉萎缩，肌肉功能下降，以及肾虚血瘀，久病致瘀，从而影响身体各脏器的正常运转所表现的体质量减弱。故实验结合了多种行为学检测方式以期达到对临床PD模型的立体化呈现。发现通过地黄饮子加减方干预后的大鼠体质量明显高于未治疗前，与人类PD肾虚血瘀证治疗后的体质量表现相同。而行为学及悬挂实验大鼠评分DHYZ组均高于SXXY组，差异有显著统计学意义。此外，此实验大鼠的免疫组化法结果显示，SXXY组大鼠黑质纹状体中α-syn平均光密度升高，DHYZ组内α-syn平均光密度降低，提示地黄饮子加减方能够作用于α-syn，且可在镜下观察到其聚集体，但表达含量过低对于检测黑质纹状体α-syn是否有特异性仍有待研究。实验将体质量、多类行为学检测法、黑质纹状体内α-syn平均光密度值及免疫组化法结合，证实了地黄饮子加减方对PD肾虚血瘀证黑质纹状体内α-syn的含量具有影响，且α-syn含量表达呈下降趋势，为临床进一步研究PD肾虚血瘀证的特征神经病理变化，改善治疗方案，提升治疗效果等提供了实验基础。但PD肾虚血瘀证致病涉及多种蛋白多种因素的共同参与，且病程漫长易生他变。由此可见地黄饮子加减方可有效降低PD肾虚血瘀证大鼠黑质纹状体内α-syn含量。但地黄饮子加减方可否能够通过对其他蛋白或其他因素影响肾虚血瘀证PD大鼠尚未可知，仍有待进一步研究。