张婷婷

[摘要] 目的  研究血標本在应用化学发光免疫分析法检测HIV抗体时对检测结果的影响。方法 自我院体检中心2020年1-12月间接受健康体检的人群中选出100名志愿者，均采集外周静脉血标本，将标本分成4份，1份为正常合格标本（未溶血组），将血液标本人工溶血成游离血红蛋白<60 mmol/L（轻度溶血组）、（60～110） mmol/L（中度溶血组）、>110 mmol/L（重度溶血组），采用酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析法对四组标本进行HIV抗体检测，对比吸光度A值和化学发光值（RLU）。结果 应用酶联免疫吸附法检测的血液标本，随着溶血程度的提高，吸光度A值也明显提高（P<0.05）;其中中度溶血组和重度溶血组的吸光度A值明显高于未溶血组（P<0.05）;中度溶血组有2例假阳性，重度溶血组有6例假阳性。应用化学发光免疫分析法检测的血液标本中：未溶血组的RLU值与轻度、中度、重度溶血组的RLU值比较，差异均无统计学意义（P>0.05），且轻度溶血组和中度溶血组均无假阳性，仅重度溶血组有1例假阳性。结论 在HIV抗体检测中：溶血标本对应用酶联免疫吸附法检测的结果影响较大，对化学发光免疫分析法检测的结果影响较小，但是随着溶血程度的加重，应用化学发光免疫分析法检测也可能出现假阳性，因此需加强检验前质量控制，保证标本的合格。

[关键词] 溶血标本;HIV抗体;化学发光免疫分析法;酶联免疫吸附法;假阳性

[中图分类号] R446          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2022）08-0107-04

Effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay

ZHANG Tingting

Clinical Laboratory Center， Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine， Shenyang   110032， China

[Abstract] Objective To study the effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay （CLIA）. Methods A total of 100 volunteers were selected from the population undergoing health examination in our physical examination center from January 2020 to December 2020， and peripheral venous blood specimens were collected from these volunteers. The specimens were divided into four groups， which were respectively the normal qualified specimens （non-hemolyzed group）， free hemoglobin < 60 mmol/L （mildly hemolyzed group）， free hemoglobin in the range of 60～110 mmol/L （moderately hemolyzed group）， and free hemoglobin > 110 mmol/L （severely hemolyzed group） from the blood specimens that were artificially hemolyzed. The four groups of specimens were detected for HIV antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and CLIA， and the absorbance （A values） and chemiluminescence values （relative light unit， RLU） were compared between the four groups. Results The A values of the blood specimens detected by ELISA increased significantly with the increase of the degree of hemolysis （P<0.05）. The A values of the moderately hemolyzed group and the severely hemolyzed group were significantly higher than those of the non-hemolyzed group （P<0.05）. There were two pseudo positives in the moderately hemolyzed group and six pseudo positives in the severely hemolyzed group. In the blood specimens detected by CLIA， there were no statistically significant differences between the RLU values of the non-hemolyzed group and those of the mildly， moderately and severely hemolyzed groups （P>0.05）. In addition， there were no pseudo positives in the mildly and moderately hemolyzed groups， and there was only one pseudo positive case in the severely hemolyzed group. Conclusion In the detection of HIV antibodies， hemolyzed specimens have a greater impact on the results of ELISA and a smaller impact on the results of CLIA. However， as the degree of hemolysis increases， pseudo positives may also occur in CLIA. Therefore， it is necessary to strengthen pre-detection quality control to ensure that the specimens are qualified.

[Key words] Hemolyzed specimens; HIV antibodies; Chemiluminescent immunoassay; Enzyme-linked immunosorbent assay; Pseudo positive

艾滋病是常见的一种传染性疾病，其经血液、性交、静脉吸毒等途径传播，该病可破坏人体的免疫功能，导致反复感染，难以治愈[1-2]，艾滋病严重威胁着人们的生命健康[3]。在我国，艾滋病的疫情流行状况大致是从高危人群向普通人群扩散，从局部向整体扩散。当前尚无治疗HIV的特效药物以及预防疫苗，因此加强对艾滋病的筛查，控制传染源，切断传播途径就显得尤为重要[4-5]。检测血清中的HIV抗体是临床上诊断艾滋病的主要依据，而不同的检测方法的结果可能存在一定差异，酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析法是目前最常用的两种方法，其中化学发光免疫分析法具有自动化程度、灵敏度和特异度高的特点[6]，正在逐渐取代酶联免疫吸附法。但在实验室检验工作中发现，溶血会对多种检测结果产生一定影响。本文特探讨溶血对HIV检测结果的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

自我院体检中心2020年1-12月接受健康体检的人群中选出100名志愿者，纳入标准[7]：（1）未感染HIV病毒。（2）年龄18～89岁，性别不限。（3）自愿参与本研究，签署知情同意书。排出标准[8]：（1）合并先天性疾病、重要脏器功能障碍、免疫系统疾病等患者。（2）合并其他传染疾病者。（3）合并认知交流障碍、精神疾病者。（4）临床资料不完整者。本组100例志愿者中：男47例，女53例，年龄23～78岁，平均（42.9±11.3）岁;BMI指数为（17.3～25.6） kg/m2，平均（21.9±1.0）kg/m2。100例志愿者均在相同条件下采集4份标本，将标本分成未溶血组、轻度溶血组、中度溶血组和重度溶血组，四组标本的一般资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）ELISA法检测应用的仪器与试剂为BIO-RAD 680酶标仪、MINDRAY MW-12A洗板机，同时由万泰生物药业股份有限公司提供配套的ELISA法HIV抗体诊断试剂盒。化学发光免疫分析法应用的仪器与试剂为LIAISON XL发光仪及配套试剂（由SORIN公司提供）。（2）具体方法：100名志愿者均采集肘正中静脉血10 ml到离心管中，分成4份，1份为肉眼无可见的溶血、脂血、黄疸的正常合格标本，设为未溶血组（n=100），待血液凝固后，将凝固后的血液标本置于离心机上以4000 r/min的速度离心10 min左右，然后取上层血清。其余3份标本则采用物理振荡和反复冻融的物理方法进行人工溶血，然后分离血清，采用邻里氨甲苯胺法测定游离血红蛋白，确定标本的溶血程度，分别为游离血红蛋白<60 mmol/L（轻度溶血组，n=100）、（60～110） mmol/L（中度溶血组，n=100）、>110 mmol/L（重度溶血组，n=100）。对4组血液标本进行HIV抗体检测，分别采用酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析法检测，按照仪器的操作说明手册、配套试剂的使用说明书等规范检测，为保证检测结果的可比性，检测时保证在一个实验室内完成，检测的试剂采用同一批次。

1.3 观察指标

对比同一标本在溶血前后的吸光度A值和化学发光值（RLU），其中化学发光免疫分析法检测的判断标准是：当化学发光值≥临界值（CO）时判定为阳性;ELISA法的判断标准：吸光度A值≥临界值时判定为阳性[9]。初筛为阳性者需重新采集标本复检，若仍为阳性，则需送疾控中心用免疫印迹法认证。

1.4 统计学方法

使用SPSS24.0软件检验数据资料，计量资料比较采用t检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组标本的检测结果

见表1所示，采用酶联免疫吸附法检测的标本，随着溶血程度的提高，吸光度A值也明显提高（P<0.05）;其中中度溶血组与重度溶血组的吸光度A值明显高于未溶血组（P<0.05）。在化学发光免疫分析法检测中：未溶血组与不同程度溶血组的RLU值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 四组的阳性率比较

见表2所示，应用酶联免疫吸附法检测的标本，其中中度溶血组有2例假阳性，重度溶血组有6例假阳性;而化学发光免疫分析法检测仅重度溶血组有1例假阳性。

3 讨论

3.1 艾滋病的流行特点概述

艾滋病（AIDS）是危及人类生命健康的一类传染疾病，是目前在全球内流行的一种传染病。近40年来，全球每年因艾滋病致死的人数就在2500万以上。在我国，1985年首例艾滋病病例被报道，此后艾滋病病例逐渐增多。据流行病学调查显示：近年来我国的艾滋病发病率呈上升趋势，在地域分布上呈西高东低、南高北低的趋势，部分地区高低波动，西南地区、新疆是艾滋病的高发地区。目前临床上尚无特效药物治疗，而且在性解放、人口流动大、毒品交易、同性恋等泛滥的社会环境中，HIV感染疫情严重。由于艾滋病的潜伏期长，初期HIV感染者无明显症状，不易被发现，继而可通过血液、性交等方式传播给他人，造成艾滋病的泛滥。因此，加强对普通人群的HIV抗体检测，及时筛查出HIV感染或AIDS患者，对于控制传染源、切断传播途径具有重要意义。

3.2 HIV抗体检测的两种方法

而HIV感染的诊断鉴别是严谨的临床工作，其诊断结果需要高度精确。目前以HIV抗體检测为主，不同的检测方法、检测试剂等均可能导致检测结果的不准确，造成假阳性。（1）酶联免疫吸附法（ELISA）是检测HIV抗体的常用方法之一，但是其操作流程相对繁琐，一般需1～2 h才能出检测结果，耗时长。操作过程中的反复加氧和洗板等操作增加了结果的误差[10-11]，对于HIV浓度低的标本，应用该法检测的灵敏度偏低，易出现假阴性。尤其是溶血标本对ELISA检测结果的影响较大，这主要是因为游离血红蛋白具有过氧化物酶活性，其与辣根过氧化物酶作用相似，在ELISA检测中可催化底物显色，导致假阳性结果。（2）化学发光免疫分析法于20世纪90年代被引入到HIV抗体检测中，该方法是将化学发光或生物发光体系与免疫反应结合起来的一种技术，被用于检测微量抗原或抗体的新型标记免疫测定技术，其工作原理与放射免疫、酶免疫相似，但是也有其独特的特点，化学发光免疫分析法是借助发光底物自身的发光强度来直接测定，测得的光量子数和待测样本中的抗原/抗体浓度成正比，因此该方法可用于定性、定量、半定量测定中[12]。在检测的工作原理上与ELISA不同，其不受游离血红蛋白中类过氧化物酶活性的影响，不会产生颜色反应影响检测结果。化学发光免疫分析法是一种异相免疫分析方法，抗原抗体能高效结合，灵敏度可达（10～22）mol/L，线性范围较宽，其发光强度在4～6个量级，与待测物质浓度呈线性关系。且分析方法简单，大多数情况下仅需加入一种试剂或复合试剂就能完成全自动化的操作。操作过程中无需任何光源照射，避免了光源稳定性、光散射等因素的干扰，结果较为稳定，误差小。除此之外，化学发光免疫分析法的耗时短，能随时检测，适用于急诊快速检验中。

3.3 溶血标本对ELISA法检测HIV抗体结果的影响

溶血标本会对多种检测项目的结果产生一定影响，可能导致假阳性、假阴性等结果，影响临床诊疗。本次研究中分析溶血标本对HIV抗体检测结果的影响，结果显示：对采用ELISA检测的标本，随着血液标本的溶血程度加重，吸光度A值也逐渐提高，且假阳性率也逐渐提高（P<0.05）;其中中度溶血组的假阳性率为2.0%，重度溶血组的假阳性率为6.0%，说明对于采用ELISA法检测HIV抗体时，标本的溶血会对检测结果产生明显影响，极易出现假阳性结果，影响临床诊疗。出现这一结果的原因可能是：（1）ELISA检测中，由于溶血后的血液标本中游离血红蛋白增加，在温育操作中，血液中游离的血红蛋白会被吸附到反应孔中。血红蛋白中的亚铁血红素具有类似于过氧化物酶的作用，能在氧化剂的作用下催化显色，因此溶血标本检测时游离血红蛋白可能会与加入的化学发光底物液发生一定的反应，出现异常显色结果，导致假阳性，或是检测结果偏高[13]。（2）血红素的红色会干扰比色分析，一般可通过标本空白部分来消除比色分析中的干扰，但是由于检测中增加光的吸收，故而在波长相近的比色试验中依然会产生一定的干扰性，影响检测结果的准确性。因此ELISA检验中受到标本溶血的影响较大。

3.4 溶血标本对化学发光免疫分析法检测HIV抗体结果的影响

对于采用化学发光免疫分析法检测的标本，未溶血组与轻度溶血组、中度溶血组、重度溶血组的RLU值对比差异均无统计学意义（P>0.05），且仅重度溶血组有1例假阳性，假阳性率为1.0%，提示我们化学发光免疫分析法检测HIV抗体时，标本的溶血对检验结果的影响不大，主要是因为：化学发光免疫分析法的特异度高，一般不会受到各种因素的影响，假阳性率低。检测一般在封闭的流动系统中进行，从而避免了交叉感染的发生，也保障了试剂的稳定性，保证了检测结果的稳定性和准确性。在HIV抗体检测中应用化学发光免疫分析法耗时短，一般可在20 min内完成检测，大大缩短初筛报告的出具时间，其检测耗时明显短于ELISA法。另外，化学发光免疫分析法的检测灵敏度、特异度也高于ELISA法，因此具有更明显的优势[14-15]。

在实验室的检验工作中，血液标本极易发生溶血现象，如血标本送检延迟、血标本采集操作不当等均可能导致溶血现象。而对于溶血标本，检验科需尽快与送检科室联系，并分析溶血的原因，结合检验项目以及临床实际。若检测项目受溶血的影响较大，需及时通知相关医护人员和受检人员重新采集血标本，以保证检测结果的准确性。另外还需加强对血标本采集人员的培训教育，提高采集人员的业务能力，尽可能减少溶血标本。

综上所述，溶血标本在ELISA检测HIV抗体时影响较大，易出现假阳性结果;对采用化学发光免疫分析法检测HIV抗体时影响不大。化学发光免疫分析法具有耗时短、灵敏度和特异度高、线性范围广、自动化程度高等优点，值得在HIV抗体检测中应用，同时还应加强对溶血标本的管理，避免溶血对检测结果造成的不良影响，保证检测结果的准确性。

[参考文献]

[1]   Peletz R， Mahin T， Elliott M， et al. Water， sanitation， and hygiene interventions to improve health among people living with HIV/AIDS： A systematic review[J].AIDS，2013，27（16）：2593-2601.

[2]  Hoover  DR，Cohen  M，Pearce  CL，et al. Association of self-reported race with AIDS death in continuous HAART users in a cohort of HIV-infected women in the United States[J].AIDS，2013，27（15）：2413-2423.

[3]   朱传凤，王玲玲，潘志荣.溶血、脂肪血及保存条件对HBV DNA、HIV RNA核酸检测的价值体会[J].世界最新医学信息文摘（连续型电子期刊），2020，20（20）：168，170.

[4]   王強，王东生，卢小岚， 等.三种方法在不同状态低值血清HIV Ag/Ab筛查中的效果评价[J].中国热带医学，2017，17（5）：460-463.

[5]   石国瑞，李巧改.HIV抗体筛查实验室室内质量控制分析及影响因素[J].河南预防医学杂志，2018，29（9）：660-662，665.

[6]   张巧安.ELISA法和化学发光法对血清中HIV-1 HIV-2抗体、梅毒抗体和丙肝抗体的检测意义[J].广东微量元素科学，2016，23（5）：17-19.

[7]   王雨涵，王洁，周炜鑫，等.化学发光微粒子免疫分析检测HIV抗体的高灵敏度及低值阳性结果分析与处理[J].中国皮肤性病学杂志，2019，33（7）：845-848.

[8]   赵菲，王新明.化学发光法检测HIV抗体在血液筛查中的应用评价[J].实验与检验医学，2019，37（5）：964-967.

[9]   詹诣，奚敏芬，顾颖慧，等.化学发光免疫分析法与酶联免疫法检测艾滋病抗体时的对照分析[J].当代医学，2020，26（22）：146-147.

[9]   邹标，王圆美，邱锡荣.酶联免疫吸附试验检测艾滋病病毒抗体的失控原因分析[J].当代医学，2019，25（29）：153-154.

[10]  郑涛，孙华宝，罗芳， 等.溶血标本在化学发光免疫分析法检测HIV抗体检验结果的影响分析[J].当代医学，2020，26（21）：169-170.

[11]  万小春.溶血标本对化学发光方法检测献血者四项传染病指标的影响[J].中国实用医药，2017，12（21）：191-192.

[12]  师毅，杜娟花.化学发光法和胶体金法检测HIV抗体与免疫印迹法确诊结果分析[J].延安大学学报（医学科学版），2017，15（1）：51-52.

[13]  何君，吴学春，邢艳.探讨溶血、乳糜血、自身抗体对HIV抗体初筛结果的影响[J].东南大学学报（医学版），2016，35（1）：54-57.

[14]  李永刚，李宁，易福凌.化学发光免疫分析法与酶联免疫法检测艾滋病病毒抗体的效果比较[J].实用临床医药杂志，2019，23（23）：14-16.

[15]  王雪梅，李代渝，江灵，等.溶血对ELISA与化学发光免疫检测HIV抗体的影响[J].现代检验医学杂志，2014， 29（2）：94-96.

（收稿日期：2021-02-18）