徐晶晶　　柯月琴　　戴晓燕　　周瑜　　舒国斌　　童世红

[摘要] 目的 探究银杏黄酮在紫外线辐射诱导的皮肤损伤和老化中的作用。方法 实验随机分为正常组、模型组和银杏黄酮20 mg/L组、40 mg/L组、80 mg/L组。结果 与正常组比较，模型组细胞活力显著降低（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著升高细胞活力（P<0.05）。与正常组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），线粒体膜电位显著降低（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著降低细胞凋亡率（P<0.05），显著升高线粒体膜电位（P<0.05）。结论 银杏黄酮对紫外线辐射诱导的皮肤成纤维细胞损伤具有保护和延缓光老化的作用。

[关键词] 银杏黄酮;紫外线辐射;皮肤老化;氧自由基

[中图分类号] R751          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）08-0012-04

Role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging

XU Jingjing1 KE Yueqin1   DAI Xiaoyan2   ZHOU Yu3   SHU Guobin1   TONG Shihong4

1.Department of Dermatology， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo   315800， China; 2.Outpatient Infusion Room， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo   315800， China; 3.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo   315800， China; 4.Stoma Wound Care Specialist Clinic， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo   315800， China

[Abstract] Objective To investigate the role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging. Methods The experimental subjects were randomly divided into the normal group， the model group， ginkgo flavonoids 20 mg/L group， ginkgo flavonoids 40 mg/L group， and ginkgo flavonoids 80 mg/L group. Results Compared with the normal group， the cell viability in the model group was significantly decreased （P<0.05）; compared with the model group， the cell viability in the ginkgo flavonoids group significantly was increased （P<0.05）. Compared with the normal group， the apoptosis rate of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential in the model group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the apoptosis rate of the ginkgo flavonoids group was significantly decreased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential of the ginkgo flavonoids group significantly increased （P<0.05）. Conclusion Ginkgo flavonoids have a protective effect on skin fibroblast injury induced by ultraviolet radiation and delays photoaging.

[Key words] Ginkgo flavonoids; Ultraviolet radiation; Skin aging; Oxygen free radicals

皮肤是机体应对外界物理、化学和环境污染物的首要防御屏障[1]。多种环境因素作用于皮肤病的发生，其中日光紫外线辐射是引起皮肤病的一个重要因素。近年来由于自然环境破坏，紫外线輻射日益加剧，由此引起的皮肤病发病率逐年增高。银杏叶提取物以银杏的叶子为原料，该产品作用包括促进血液循环、抗氧化、抗衰老、抗痴呆、降低血压、改善糖尿病等。有研究表明，银杏黄酮在临床上已用于心脑疾患等多种疾病的治疗[2-3]，而对拮抗皮肤老化是否有明确的意义尚不明了。本实验旨在探讨银杏黄酮在紫外线辐射诱导的皮肤损伤和老化中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与药品

人皮肤成纤维细胞购自中国科学院典藏细胞库。银杏黄酮购自深圳市思美泉生物科技有限公司，货号90045-36-6，纯度>99%。

1.2 方法

1.2.1 分组  体外培养人体正常皮肤成纤维细胞，随机分为正常组、模型组和银杏黄酮20 mg/L组、40 mg/L组、80 mg/L组。除正常组外，其余各组经紫外线（使用UVA+UVB同时照射，照射总量为UVA：4.2 J/cm2;UVB：0.5 J/cm2）照射，在不同时间段（0、3、12、48 h）分别收集细胞并保存。

1.2.2  MTT检测细胞活力  细胞培养，每孔分别加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培养箱中继续孵育4 h后弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振荡反应10 min，用酶标仪检测细胞活力。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位水平    各组细胞，以每孔1×104个接种于24孔板中。加入10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。再加入5 μl PI，室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

取500 μl单细胞悬液，加入Rhodamine 123染液10 μl，37℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测。激发波长507 nm，计数104个细胞，测定单个细胞荧光，用Rhodamine 123的荧光强度变化表示细胞线粒体膜电位。

1.2.4 细胞老化相关β-半乳糖苷酶的活性测定  各组细胞按照5.0×104个ml的細胞密度接种，用40 g/L多聚醛固定细胞45 min，用X-Gal染液在37℃保温4～8 h，再固定4 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。确定细胞老化相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比。

1.2.5 RT-qPCR检测基因表达  各组细胞均提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s;72℃ 30 s，共40个循环;60℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达  提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。SDS-PAGE后，转移至PVDF上;分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜;再加入二抗室温孵育2 h，后在暗室中曝光显影，再定影，将胶片用Quantity One软件分析各蛋白条带蛋白表达。

1.2.7 荧光分析法检测细胞内OH、NO含量  在Tris-HCl缓冲溶液中，邻苯三酚自氧化产生超OH、NO和有荧光效率的自氧化产物。在433.0 nm激发波长和494.5 nm发射波长条件下，检测细胞内OH、NO含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较

与正常组比较，模型组细胞活力显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著升高细胞活力，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组细胞凋亡率和线粒体膜电位比较

与正常组比较，模型组细胞凋亡率显著升高、线粒体膜电位水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著降低细胞凋亡率，显著升高线粒体膜电位水平，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组细胞β-半乳糖苷酶的活性比较

与正常组比较，模型组β-半乳糖苷酶的活性染色阳性率显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著降低β-半乳糖苷酶的活性染色阳性率，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 各组基因表达水平比较

与正常组比较，模型组Bcl-2、iNOS mRNA表达显著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著升高Bcl-2、iNOS mRNA表达，显著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 各组蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组Bcl-2、iNOS蛋白表达显著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著升高Bcl-2、iNOS蛋白表达，显著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.6 各组细胞内OH、NO含量比较

与正常组比较，模型组细胞内OH、NO含量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，银杏黄酮显著降低细胞内OH、NO含量，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表6。

3 讨论

皮肤老化是由于紫外线长期辐射后，导致皮肤质量下降[4-5]。UVB照射可导致皮肤出现皱纹、色素沉着、松弛等光老化现象[6-7]。UVA作用于细胞，在细胞内能产生ROS。高水平的ROS引起细胞内的氧化应激，影响CD95/CD95L凋亡通路和多种凋亡相关基因的表达;同时活化细胞内的ROS，启动线粒体的去极化，使线粒体膜通透性增加，出现皮肤光老化[8-9]。

药理学研究表明，银杏叶提取物具有改善血液循环、降低心肌耗氧量、保护心脑血管、提高机体免疫功能等作用[10-11]。本实验结果表明，人皮肤细胞损伤和老化后细胞活力显著降低;而银杏黄酮可以提升损伤细胞的活力。高阳等[12]研究发现，银杏黄酮处理后细胞存活率显著提升。

本研究同时发现，人皮肤细胞损伤和衰老后，β-半乳糖苷酶的活性染色阳性率显著提高，但银杏黄酮可显著降低β-半乳糖苷酶表达。葛志华等[13]研究表明，衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶表达增加，凋亡细胞数较正常组明显增多。

赵丽等[14]研究发现，银杏黄酮苷元可以下调Bax基因表达，上调Bcl-2基因表达。黎小琼[15]研究表明，CD95、CD95L广泛表达于多种上皮细胞的表面。陈志国等[16]研究表明，CD95/CD95L在胃癌组织中的表达显著高于良性疾病组及正常胃黏膜组。窦婷婷[17]研究表明，pttg1在皮肤肿瘤中的表达显著高于正常水平。本实验研究发现，人皮肤细胞损伤和衰老后，Bcl-2基因和蛋白表达显著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD基因和蛋白表达显著升高，但银杏黄酮可显著改善损伤和衰老。

银杏黄酮类成分是银杏叶提取物具有独特药理活性的药效成分，具有抗氧化、清除自由基等功能[18-19]。清除自由基和活性氧，主要体现在抑制细胞内COX-2和iNOS的活性[20]。本研究表明，人皮肤细胞损伤后细胞内OH、NO含量显著升高、iNOS基因和蛋白表达显著降低、COX-2基因和蛋白表达显著升高;而不同浓度的银杏黄酮显著降低细胞内OH、NO含量，显著升高iNOS基因和蛋白表达，显著降低COX-2基因和蛋白表达。

综上所述，银杏黄酮对紫外线辐射诱导的皮肤成纤维细胞损伤具有保護和延缓光老化的作用。

[参考文献]

[1]   Ebi KL，McGregor G. Climate change，tropospheric ozone and particulate matter，and health impacts[J].Environ Health Perspect，2008，116（11）：1449-1455.

[2]   谢威义.银杏叶提取物治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变的临床疗效分析[J].中国现代医生，2018，56（9）：73-75.

[3]   葛茸茸，沈炜.银杏黄酮靶蛋白信号通路介导转化生长因子-β2诱导的后发性白内障的分子机制研究[J].海军医学杂志，2016，37（6）：497-499.

[4]   吴斯敏，杨慧龄.紫外线引起皮肤光老化机制及防治的研究进展[J].医学综述，2018，24（2）：341-346.

[5]   王小燕，刘子菁，马仁燕，等.皮肤光老化研究新进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2019，35（5）：305-308，312.

[6]   陈琳.射频联合点阵激光治疗面部皮肤光老化的临床疗效及应用价值[J].现代诊断与治疗，2017，8（14）：124-125.

[7]   秦锋，张文超，张明子，等.脂肪来源间充质干细胞治疗皮肤老化的研究进展[J].中国美容整形外科杂志，2020， 31（4）：244-246，253.

[8]   王继慧.绞股蓝总皂苷对人皮肤成纤维细胞光老化模型凋亡信号通路的影响[D].沈阳：辽宁中医药大学，2014.

[9]   梁书旗，吴新军，李岩，等.LncRNA ROR在脂肪源性干细胞中的过表达对面部皮肤老化的影响[J].分子诊断与治疗杂志，2021，13（4）：619-622.

[10]  涂清波，孙云，许婷，等.银杏双黄酮药理作用的研究进展[J].山东医药，2018，58（19）：112-114.

[11]  龚婕，马良娟.皮肤光老化和抗氧化剂研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2019，35（11）：692-695.

[12]  高阳，康凯，王慧.银杏黄酮对缺氧复氧心肌H9c2细胞损伤的保护作用及其机制[J].遵义医科大学学报，2019， 42（5）：539-542.

[13]  葛志华，孙立新，李俊玫，等.实验性衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶、TUNEL的改变[J].现代口腔医学杂志，2010，24（2）：125-127.

[14]  赵丽，何艳，刘兴德. 银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白诱导的人主动脉内皮细胞凋亡的保护作用[J].中国临床药理学杂志，2014，30（6）：546-549.

[15]  黎小琼.CD95/CD95L促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和炎症的作用[D].广州：广州中医药大学，2012.

[16]  陈志国，王正文，谭顺.胃癌组织中CD95/CD95L的表达[J].第四军医大学学报，2009，30（8）：752.

[17]  窦婷婷.垂体瘤转化基因-1（PTTG1）在银屑病及皮肤肿瘤中的研究[D].杭州：浙江大学，2015.

[18]  李保同，徐永霞，李娟，等.纤维素酶-微波辅助提取银杏叶总黄酮及抗氧化性能研究[J].现代化工，2016，36（3）：67-70.

[19]  杨翠娥，王慧.银杏黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的保护作用[J].卒中与神经疾病，2019，26（6）：660-663.

[20]  张兆敏，杨睿，高成岩，等.银杏黄酮对高糖诱导肾小球系膜细胞氧化应激的保护作用[J].中国中西医结合肾病杂志，2018，19（1）：43-44.

（收稿日期：2021-04-01）