王 雪 ， 周 航 ， 胡人阁 ， 孔令聪，2 ， 马红霞

(1. 吉林农业大学动物医学院 , 吉林 长春 130118 ； 2. 吉林省新兽药研发与创制重点实验室 ， 吉林 长春 130118 ； 3. 吉林农业大学生命科学学院 , 吉林 长春 130118 ； 4. 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心 ， 吉林 长春 130118)

沙门菌属(Salmonella)包含多达6个亚种和2 600多个血清型，其中的致病性沙门菌不仅与动物疾病密切相关，而且可以感染人类引起人兽共患病[1]。据欧盟最新报告显示，9 061例人类食源性病例中有1 067例与沙门菌病有关，甚至导致128人死亡(占所有食源性病例的0.25%)[2]。同时，伤寒沙门菌引发的肠炎仅在东南亚地区每年便造成多达60万人死亡[3]。总之，沙门菌感染所引起的疾病给公共卫生安全带来了极大的威胁，深入研究沙门菌致病机制对控制该病至关重要。

致病性沙门菌通过由Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)组成的复杂机制传递一组特殊效应物，这些效应子协同操纵宿主细胞的多个信号通路来驱动病原体内化，使其侵入非吞噬性肠上皮细胞并引发炎症反应，这在沙门菌的发病机制中起着至关重要的作用。

沙门菌毒力岛1(Salmonellapathogenicity island 1,SPI-1)已经被证明可以编码T3SS-1，这一分子注射器可以直接将一组毒力效应蛋白导入宿主细胞。SPI-1位于染色体第63位，由大约40个基因组成，包括39个编码T3SS-1及其伴侣蛋白和效应蛋白的基因，以及一些用于调控SPI-1毒力基因表达的转录调节因子[4]。虽然入侵效应物的生化活性已被广泛描述，但它们在入侵过程中发挥的多重作用并未被充分发掘。本文对SPI-1在沙门菌入侵宿主细胞中的作用、调控机制和效应蛋白分类进行综述。

1 SPI-1的作用

SPI-1在沙门菌与宿主细胞的相互作用中至关重要，其编码的T3SS-1介导沙门菌对上皮细胞的侵袭[5]。T3SS核心部件是出口装置和针状复合物。出口装置由蛋白质InvA、SpaP、SpaQ、SpaR和SpaS组成，是针状复合物基部的起始结构，对基部的组成和稳定性至关重要，并使针状复合物具有分泌效应因子的能力[6]。针状复合物由跨越细菌包膜的多环圆柱形基部和从细菌外表面突出的针状延伸物组成。其中，多环圆柱形基部由3种等摩尔量蛋白质构成：InvG构成外环，PrgH和PrgK形成剩余结构[7]。针状延伸物由胞外针、针尖复合物和易位子组成，其中PrgI是胞外针结构主要组成部分。InvJ控制针段的长度。PrgJ在基部形成一个固定针的内杆，其在细菌细胞质和宿主细胞膜之间形成导管，将细菌的效应蛋白注入宿主细胞[8]。针尖复合物由针尖蛋白SipD与针尖亚基PrgI相互作用形成，其能有效控制效应蛋白的分泌，调节沙门菌入侵宿主细胞[9]。在沙门菌与宿主细胞接触后，SipD与转位蛋白SipB、SipC形成一个易位子的平台，易位子在宿主细胞膜上形成孔，使效应蛋白直接进入宿主细胞质，促进沙门菌侵袭宿主细胞[10]。这些易位子由沙门菌SPI-1编码，其在沙门菌与宿主细胞的接触和侵袭以及哺乳动物肠道上皮细胞的定植过程中发挥重要作用。

除了入侵外，SPI-1还参与细胞内复制、干预宿主反应、逃避监控以利于沙门菌的生存[11]。研究发现，SPI-1编码的蛋白质参与沙门菌感染宿主细胞的复杂免疫反应。Pavlova等[12]用沙门菌及其SPI-1缺失突变体分别感染猪肺泡巨噬细胞，结果表明SPI-1编码的T3SS-1不仅用于细胞侵袭，而且用于抑制巨噬细胞早期促炎细胞因子的表达，包括IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-23α、GM-CSF和IL-18。此外，Zhao等[13]发现SPI-1参与巨噬细胞MHC-II下调和M2表型极化。Chaudhuri等[14]通过对感染沙门菌小鼠脑部不同部位的细菌浓度分析发现，沙门菌SPI-1和外膜蛋白A基因提高了血脑屏障的渗透性，促使沙门菌穿过血脑屏障到达不同的脑组织，导致中枢神经系统感染并引发脑损伤。

2 沙门菌SPI-1 T3SS-1效应蛋白

许多革兰阴性细菌病原体运用T3SS将其自身蛋白质(即效应蛋白)注入到宿主细胞中，以调节某些细胞功能。截至目前，在沙门菌中已鉴定出许多SPI-1效应蛋白，这些效应蛋白在沙门菌感染过程中发挥多种作用，包括参与宿主细胞骨架的重排、免疫细胞募集、细胞代谢以及宿主炎症反应的调节[15]。SPI-1效应因子主要在沙门菌处于细胞外并允许侵入非吞噬细胞时起作用，SPI-2则在内化后被激活并起到促进含沙门菌空泡(Salmonellacontaining vacuole，SCV)发育的作用。其中编码T3SS-1的SPI-1效应蛋白及其功能见表1。

表1 沙门菌分泌效应蛋白及其在疾病中的作用

2.1 AvrA AvrA是乙酰转移酶家族的一员，全长33 kDa，在沙门菌入侵初期被转位至肠上皮细胞，其在抑制炎症、调节细胞凋亡和促进增殖等方面发挥着重要作用。虽然沙门菌感染细胞会发生凋亡并激活促炎反应，但研究显示AvrA蛋白抑制了这2种宿主反应，可能是为避免宿主适应性免疫而建立了一个稳定的细胞内生态位[16]。主要表现为通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)来阻断炎症前体NF-κB转录因子的激活并抑制细胞凋亡。Wu等[17]发现，缺乏AvrA的沙门菌可引起肠道炎症增加，导致系统性细胞因子反应加强，并促进上皮细胞凋亡，同时加剧上皮外巨噬细胞的凋亡，结果表明AvrA可能通过抑制JNK来调节被感染巨噬细胞的存活，阻止巨噬细胞的死亡并降低细菌传播速度，进而建立一个稳定的细胞内病原体。此外，AvrA是一种去泛素酶，能够去除核因子κB通路(Nuclear factor-κB,NF-κB)抑制蛋白IκBα和β-catenin的泛素，从而阻断NF-κB通路激活，抑制宿主的炎症反应。Lu等[18]发现，AvrA缺陷的沙门菌菌株加速IκBα和β-连环蛋白降解，促进IL-6分泌、c-myc和cyclin D1 的表达，结果表明AvrA在菌株中的表达可抑制炎症反应，增加β-连环蛋白的转录活性，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡并导致肿瘤形成。

2.2 Sips 沙门菌入侵蛋白(Salmonellainvasion protein,Sips)分为4类，即Sips A～D。这些Sips输出并转运到宿主细胞质膜或胞浆中，在SPI-1效应蛋白的分泌和转运过程中起重要作用。

2.2.1 SipA SipA是一种肌动蛋白结合蛋白，通过影响不同阶段细胞膜褶皱的形成和肌动蛋白细胞骨架重排来提高沙门菌进入宿主细胞的效率。研究表明SipA在沙门菌入侵部位调节肌动蛋白分子的浓度、聚合和稳定性并提高宿主细胞丝束蛋白的绑定活性[19]。同时SipA还是双重功能效应蛋白，McIntosh等[20]用荧光小标签phiLOV标记SipA，结果表明其在肠上皮细胞中促进肌动蛋白聚合并激活宿主凋亡介质Caspase-3酶，使Caspase-3在宿主细胞的免疫应答中发挥多种作用。

2.2.2 SipB、SipC和SipD SipB、SipC和SipD是参与SPI-1 T3SS针状复合物形成的转位蛋白，促进了效应蛋白在宿主细胞膜上的转运。已有研究表明这些转位蛋白可能在宿主细胞膜上形成一个通道，进而促使T3SS效应蛋白通过宿主细胞膜。其中，SipB参与沙门菌诱导的Caspase-1依赖性细胞凋亡，并通过蛋白酶Caspase-1激活IL-18，从而保障沙门菌在宿主细胞内存活[21]。SipC作用靶点是F-肌动蛋白，F-肌动蛋白是参与病原体内化和促进沙门菌入侵的重要因子。SipD的N-末端区域在转录和翻译后促进效应物的分泌和功能。

2.3 SptP 沙门菌蛋白酪氨酸磷酸酶(Salmonellaprotein tyrosine phosphatase,SptP)是一种模块化蛋白，由3个不同的结构域组成：伴侣结合结构域、间隙结构域和酪氨酸磷酸酶结构域。SptP参与介导感染后宿主细胞骨架的恢复，并通过调节绒毛蛋白磷酸化直接逆转了由沙门菌其他效应物诱导的肌动蛋白骨架改变。同时，为保证SptP最有效分泌，需要与位于其上游的伴侣蛋白SicP相互作用达到翻译的耦合[22]。Humphreys等[23]对SptP在感染细胞中寿命的进行观察，结果表明SptP介导含缬酪肽蛋白质的去磷酸化，并促进细胞膜融合和蛋白降解，增强了SCV中的病原体复制。此外，Kawakami等[24]发现SptP抑制肥大细胞的脱粒和激活，从而阻碍早期先天免疫反应并使细菌得以传播。

2.4 Sops 沙门菌外蛋白(Salmonellaouter proteins,Sops)是由SopA、SopB、SopD、SopD2、SopE和SopE2组成的一类效应蛋白。Sops参与控制不同阶段多形核白细胞内流和细胞骨架重排，有助于沙门菌入侵，导致炎症和腹泻。

2.4.1 SopA SopA可促进由沙门菌感染引起的炎症。同时，SopA稳定性和易位需要分子伴侣InvB。InvB通常结合在SopA的N-端区域，在保持效应器分泌能力及转录调控等方面发挥作用[25]。此外，SopA与宿主泛素E3连接酶HsRMA1[又名环指蛋白5(RNF5)]相互作用诱发炎症。Zhang等[26]发现SopA通过HsRMA1介导的泛素化途径被泛素化并降解。沙门菌通过SopA泛素化成功从SCV逃逸至肠上皮细胞，在细胞质中复制并导致了腹泻。另有研究表明，SopA直接介导泛素连接酶E3中三结构域蛋白家族(Tripartite motif,TRIM)56和TRIM65的泛素化以及蛋白酶体降解，从而调节固有免疫[27]。

2.4.2 SopB/SigD SopB/SigD是一种肌醇磷酸酶，抑制磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)依赖性信号传导，并参与氯化物分泌以及中性粒细胞募集。研究表明它们通过阻断磷酸肌醇信号通路和诱导蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)活化来介导毒力。Rodríguez-Escudero等[28]发现，SigD在体外将多种可溶性肌醇聚磷酸盐和肌醇磷脂脱磷酸，在体内将肌醇1,3,4,5,6五磷酸转化为肌醇1,4,5,6四磷酸，进而刺激肌动蛋白细胞骨架重排并促进细菌内化。García-Gil等[29]发现，SopB激活PI3K-Akt-YAP通路并调节B细胞中IL-1的生成。同时，SopB可诱导IL-10分泌，并阻断IL-6与IL-1β的产生，这将促进抗炎环境的形成。此外，Drecktrah等[30]通过对亚硝酸盐浓度的测量来量化一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase,iNOS)的活性，结果表明SopB刺激一氧化氮(Nitric oxide,NO)的产生用以介导毒力。

2.4.3 SopD/SopD2 SopD影响多种信号传导及蛋白质间相互作用，参与沙门菌的系统性毒力作用并导致胃肠炎。在沙门菌入侵期间，SopD与SopB 共同作用导致宿主细胞膜裂变。此外，SopD和SopD2共同作用促进沙门菌在宿主细胞内复制，并与SCV有关。其中，T3SS-2效应子SopD2有助于沙门菌诱导的丝状体形成，并抑制囊泡转运和从SCV向外延伸的小管形成，是SCV影响不稳定性的主要因素[31]。

2.4.4 SopE SopE是一种Rho-GTPase交换因子，可诱导肌动蛋白细胞骨架的快速重排、导致细胞膜皱褶、参与病原体巨胞饮作用并促进细菌侵袭。研究表明，SopE短暂定位于SCV早期并参与沙门菌细胞内复制[32]。SopE2与SopE同源，其作用机制与SopE相似。此外，SopE可通过蛋白酶体介导的途径快速降解，导致Cdc42和Rac1失活，从而逆转SopB-、SopE-和SopE2-信号通路。López-Garrido等[33]发现，在感染后第4天sopE+鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)菌株在小鼠肠道中的含量高于同基因sopE突变体，且S.typhimurium经编码SopE的噬菌体裂解后，可诱导宿主在肠道内产生iNOS，通过硝酸盐呼吸促进了肠腔内S.typhimurium的生长。说明通过水平基因转移获得一种毒力因子可以增加病原体的代谢适应度，从而促进沙门菌的生长。

3 展望

沙门菌是引起食源性肠胃炎的重要病原体，是人类和包括鸟类在内动物感染人兽共患传染病的罪魁祸首。因此，沙门菌感染是全世界公众健康、动物和食品工业的亟待解决一个主要问题。其中，沙门菌毒力岛SPI-1编码的T3SS-1系统可将效应物直接转运到宿主细胞细胞质中，对沙门菌入侵宿主细胞至关重要。虽然SPI-1效应因子大多已被发现，但对效应因子作用机制以及各个效应因子间的协同作用仍有待挖掘，且以其毒力作用为靶向应用于对沙门菌感染的控制将有助于药物的研发。目前，将肠炎沙门菌SPI-1编码的毒力蛋白作为疫苗以预防禽类肠炎沙门菌的研究方兴未艾。同时，SPI-1编码T3SS-1在抗肿瘤方面的研究也有所突破，减毒沙门菌应用于肿瘤的治疗中指日可期。为此，深入研究SPI-1及其调控网络将有助于我们进一步了解沙门菌致病机制，并对新型疫苗及抗革兰阴性菌药物的研发具有重要意义。