丁李春

（宁德市农业科学研究所 福建福安 355003）

黑牛肝菌［Phlebopus portentosud（Berk.&Broome）Boedijn.］，又名暗褐网柄牛肝菌，隶属担子菌门（Basi diomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、牛肝菌目（Boletales）、小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脉柄牛肝菌属（Phlebopus）[1]，目前普遍认为牛肝菌是一类与宿主树根系共生形成外生菌根的真菌类群，迄今为止，绝大多数种类尚未见人工栽培形成子实体的报道[2]，仅有黑牛肝菌实现了人工栽培， 栽培菌株均从野生菌分离驯化而来，且种性退化快，必须不断筛选新菌株，并掌握其生长所需营养及培养条件。 本试验从碳源、氮源、温度、pH、无机盐、含水量等6个因素对黑牛肝菌新菌株Np0193 菌丝生长的影响进行了研究，为其高效栽培提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

黑牛肝菌菌株Np0193 系宁德市农业科学研究所通过对野生黑牛肝菌组织分离筛选所得。

1.2 供试培养基

培养基1:葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂 16 g，复合维生素 B 20 mg，水 1 000 mL；培养基2：发酵木屑70% ，玉米粉20%，豆粕8%，庶糖1%，石膏1%。

1.3 试验方法

1.3.1 碳源试验 以不加葡萄糖的培养基1 为对照，分别用等量的蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖代替培养基1 中的葡萄糖作碳源， 观测不同碳源对菌丝生长的影响。

1.3.2 氮源试验 以不加蛋白胨的培养基1 为对照，分别用牛肉膏、酵母膏、乙酸铵、尿素代替培养基1 中的蛋白胨作氮源， 观测不同氮源对菌丝生长的影响。

1.3.3 温度试验 以培养基1 为菌丝生长培养基，设置 24℃、26℃、28℃、30℃、32℃ 5个温度梯度，观测不同温度对黑牛肝菌菌丝生长的影响

1.3.4 pH 试验 以培养基1 为菌丝生长培养基，设置 pH 为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 6个梯度的基础培养基（用 1 mol/L NaOH 和 1 mol/L HCl 调节 pH，使用pH 计进行 pH 测量）[3]，观测不同 pH 对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.3.5 无机盐试验 以培养基1 中不加无机盐为对照，分别用等量的硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钾、氯化钠、碳酸钙代替培养基1 中的磷酸二氢钾，观测不同无机盐对黑牛肝菌菌丝生长的影响。

1.3.6 培养料含水量试验 将培养基2 的含水量调节至50%、55%、60%、65%、70%、75%分别装入25 mm×200 mm 试管中, 每个处理 3个重复,0.147 MPa 灭菌2.5 h，接种后于28℃恒温培养,观测不同含水量对菌丝生长的影响。

1.4 接种培养

碳源试验、氮源试验、无机盐试验、pH 试验均于平板中央接种1 块直径6.5 mm 活化的菌丝块，于28℃下恒温培养， 温度试验则在设定的恒温下培养，定期（7 d、10 d、13 d）用十字交叉法[4]测量菌落直径，每个处理3 次重复。

1.5 数据分析

试验数据统计和显著性检测用Excel 2007 和SPSS 17 软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

从表1 可以看出， 以可溶性淀粉为碳源黑牛肝菌Np0193 菌丝生长整齐、菌落完整，生长速度最快为2.92 mm/d，与对照差异显著；以蔗糖、麦芽糖、果糖为碳源黑牛肝菌菌丝生长不整齐， 生长速度分别为 2.41 mm/d、2.35 mm/d、2.32 mm/d， 与对照差异显著， 菌丝生长7～10 d 后颜色开始变成褐色并伴有深褐色分泌物产生，菌丝老化快。

表1 不同碳源对黑牛肝菌菌丝生长的影响

2.2 不同氮源对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

从表2 可以看出， 在培养基1 中分别添加1 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、乙酸铵、尿素，与对照相比其菌丝的长势优于未加氮源的培养基1。其中以蛋白胨、酵母膏为氮源的菌丝生长快且最为健壮，边缘整齐， 颜色呈黄色， 生长速度分别为2.56 mm/d和2.50 mm/d， 与其他各处理菌丝生长速度相比差异显著，说明蛋白胨是黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的最佳氮源，其次是酵母膏。 在培养基1 中添加1 g/L 尿素作氮源，培养20 d 菌丝仍未生长，说明尿素添加量在一定范围内对黑牛肝菌菌丝生长有抑制作用， 这与何明霞等[5]在氮源筛选时尿素抑制菌丝生长的结论相一致。

表2 不同氮源对黑牛肝菌菌丝生长的影响

2.3 不同温度对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

从表3 可以看出，温度对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长作用十分明显， 在24～32℃温度下菌丝均能生长，30℃时菌丝生长速度最快， 达到 2.61 mm/d，到32℃时菌丝生长速度下降， 菌丝前端生长不整齐，菌丝颜色变深且易老化，接种块处形成深褐色液状分泌物；在24℃温度下菌丝生长速度最慢，为1.51 mm/d。本试验中黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的适宜温度为28～30℃，这与罗顺珍等[6]适宜黑牛肝菌菌丝生长的合成培养基及主要环境条件试验中得出的黑牛肝菌菌丝适宜生长温度为27～31℃的结论基本一致。

表3 不同温度对黑牛肝菌菌丝生长的影响

2.4 pH 对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

pH 是影响黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的主要因素之一。 从表4 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌丝生长适宜pH 为 4.5～5.5，最适为4.5，菌丝生长速度最快为2.72 mm/d，且菌丝浓密，黄色先端整齐；pH 低于4.0 或高于5.5 时，菌丝生长缓慢，菌丝索状前端生长不整齐，易形成褐色菌核。

表4 不同pH 对黑牛肝菌菌丝生长的影响

2.5 无机盐对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

从表5 可以看出， 添加7种无机盐均对菌丝的生长有抑制作用，且易出现菌丝老化、菌落褐色，菌丝生长速度均比对照慢， 但添加碳酸钙时菌丝生长整齐且比对照菌丝粗壮。 加入氯化钠时对菌丝的抑制作用最为显著，生长速度为1.5 mm/d，与对照差异显著。 添加1 g/L 无机盐对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长影响较大， 不同无机盐添加量对其生长的影响有待进一步研究。

表5 不同无机盐对黑牛肝菌菌丝生长的影响

2.6 培养料含水量对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长的影响

从表6 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌丝生长适宜含水量为55%～65%，最适为60%；低于50%或高于70%时菌丝生长缓慢、菌丝稀疏、抗逆性差，菌丝索状前端生长不整齐。

表6 不同含水量对黑牛肝菌菌丝生长的影响

3 结论与讨论

黑牛肝菌是新兴的优质珍稀食用菌， 其菌丝生长关键因素、 遗传育种和高产栽培技术等方面的研究在我国的报道尚不多见[7]。 目前黑牛肝菌人工栽培的菌株是从野生菌分离驯化而来，且种性退化快，必须不断筛选新菌株， 并掌握其生长所需营养及培养条件。本试验从碳源、氮源、温度、pH、无机盐、含水量等6个因素对黑牛肝菌新菌株Np0193 菌丝生长的影响进行了研究，为其高效栽培提供理论基础。

试验结果表明，黑牛肝菌新菌株Np0193 菌丝生长最适碳源是可溶性淀粉， 菌丝生长整齐、 菌落完整，生长速度为2.92 mm/d；适宜氮源为蛋白胨、酵母膏，菌丝生长快且健壮，边缘整齐，颜色呈黄色，生长速度分别为2.56 mm/d 和2.50 mm/d； 温度对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长作用十分明显，在24～32℃温度下菌丝均能生长，最适温度为28～30℃，30℃时菌丝生长速度最快，达到 2.61 mm/d；适宜 pH 为 4.5～5.5，最适为4.5，菌丝生长速度最快为2.72 mm/d，且菌丝浓密，黄色先端整齐，常规PDA 培养基pH 6.0 左右不适合黑牛肝菌Np0193 菌丝生长； 添加1 g/L 无机盐均对菌丝的生长有抑制作用，且易出现菌丝老化、菌落褐色，菌丝生长速度均比对照慢，降低无机盐的添加量是否对其菌丝生长有促进作用还有待于进一步研究；适宜含水量为55%～65%，最适为60%，低于50%或高于70%时菌丝生长缓慢、菌丝稀疏、抗逆性差。

液体菌种在生产上的应用是食用菌工厂化生产的必然趋势[8]。 黑牛肝菌对营养物质的需求及培养条件的要求比较严格，菌种在固体培养基上生长缓慢，缩短菌种培养时间迫在眉睫。 本试验对黑牛肝菌Np0193 菌丝生长营养物质及关键条件进行了研究，为其液体菌种的开发提供了依据。