中链脂肪酸及其酯对致病菌的抑菌作用

2021-10-09汤佳宁王永侠刘金松曾新福杨彩梅

浙江农业学报 2021年9期

汤佳宁，王永侠，刘金松，曾新福，杨彩梅，*

(1.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州 311300； 2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 311107)

抗生素滥用对畜禽养殖业具有潜在危害，寻找绿色安全的抗生素替代物成为当前动物营养研究的热点。大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum)在畜禽环境中广泛存在，它们引发的各种疾病对养殖业影响巨大[1]。大肠埃希菌病的发病率和死亡率高，暴发频繁，严重影响养鸡业的发展[2]。金黄色葡萄球菌能引起皮肤、软组织感染，以及引起心内膜炎、败血症及中毒性休克等多种疾病症状[3]。沙门氏菌能够导致雏鸡大量死亡[4]。鸡白痢是严重危害家禽养殖业的传染病[5]。

中链脂肪酸(MCFA)是指碳链长度为6～12个碳原子的饱和脂肪酸[6]。中链脂肪酸与甘油结合形成中链脂肪酸甘油酯。研究表明，月桂酸甘油酯具有抑菌作用[7]。Li等[8]报道单月桂酸甘油酯能有效防止恒河猕猴感染艾滋病毒(SIV)，为人类防止艾滋病提供了新思路，更促进了人们对月桂酸衍生物的研发。在饲料行业，单月桂酸甘油酯可以提高油脂的消化利用率，可以显著提高饲料报酬[9]，在肉鸡饲料中添加单月桂酸甘油酯对肉品质有显著的提升作用[10]，并对蛋鸡的生产性能、蛋品质及腹脂形态等具有显著的提升作用[11]。目前，中链脂肪酸甘油酯已经成为抗生素替代物研究的新热点，但除了单月桂甘油酯外，对其他中链脂肪酸甘油及其酯的研究较少，本试验旨在研究月桂酸和中链脂肪酸甘油酯(单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯)对致病菌的抑菌效果，为中链脂肪酸甘油酯的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验样品与菌种

月桂酸(lauric acid，LA)，单月桂酸甘油酯(glyceryl monolaurate，GML)，单辛酸甘油酯(glyceryl monocaprylate，GMC)，辛葵酸甘油酯(caprylic capric triglycerride，MCT)市购，纯度为90%。大肠埃希菌(Escherichiacoli)K88和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)由浙江大学惠赠；鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum)CVCC1791、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 试验设计

抑菌试验采用摇瓶法，具体步骤如下：

(1)配制LB液体培养基(称取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用ddH2O定容至950 mL，用HCl和NaOH调节pH至7.0，再用ddH2O定容至1 L)，灭菌冷却备用。

(2)设置空白对照组，只接菌不添加抑菌剂；实验组接种适宜浓度(106CFU·mL-1)的菌液并添加500 μL中链脂肪酸(酯)(分别为月桂酸，单月桂酸甘油酯，单辛酸甘油酯，辛葵酸甘油酯，50 mL，终浓度为1 mg·mL-1)。加样后用锡纸封盖以防止污染，37 ℃，180 r·min-1于摇床上振荡培养，在培养时间为0、4、8、12、24、48 h时取培养液200 μL加样于96孔板，每份样6个重复，采用酶标仪在波长600 nm处检测D值。

1.3 数据处理

所得数据用SPSS Statistics V21.0进行单因素方差(one-way ANOVA)分析，使用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 中链脂肪酸酯对大肠埃希菌的抑菌作用

由图1可得， 8～48 h，相较于对照组，月桂酸处理组大肠埃希菌生长显著(P<0.05)受到抑制。4～48 h，单月桂酸甘油酯处理组大肠埃希菌生长速度显著(P<0.05)受到抑制。单辛酸甘油酯处理的大肠埃希菌有一定程度的增殖，但生长速度显著(P<0.05)低于对照组。4～16 h，辛葵酸甘油酯处理组大肠埃希菌生长速度显著(P<0.05)受到抑制，24 h，对照组相较于辛葵酸甘油酯组大肠埃希菌无显著差异。结果表明，月桂酸、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯对大肠埃希菌抑制作用存在一定的差异。

同一时间不同处理间没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 中链脂肪酸酯对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

由图2可得，0～8 h，月桂酸处理的金黄色葡萄球菌增殖不明显，在整个试验过程中，月桂酸处理组金黄色葡萄球菌增殖速度显著(P<0.05)低于对照组。0～4 h，单月桂酸甘油酯处理组金黄色葡萄球菌增殖速度与对照组基本一致，4 h之后，单月桂酸甘油酯处理组金黄色葡萄球菌增殖速度始终显著(P<0.05)低于对照组。单辛酸甘油酯和辛葵酸甘油酯处理组金黄色葡萄球菌均始终显著(P<0.05)低于对照组。表明月桂酸、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯对金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，但存在作用时间的差异。

图2 不同中链脂肪酸甘油酯对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.3 中链脂肪酸酯对肠炎沙门氏菌的抑菌作用

由图3可得，0～4 h，月桂酸组肠炎沙门氏菌生长速度与对照组无显著差别，4 h后月桂酸组肠炎沙门氏菌增殖速度显著(P<0.05)低于对照组。单月桂酸甘油酯和单辛酸甘油酯组肠炎沙门氏菌增殖速度整个试验期间均显著(P<0.05)低于对照组。0～4 h，辛葵酸甘油酯处理组与对照组肠炎沙门氏菌增殖速度无显著差异，4 h后，辛葵酸甘油酯处理的肠炎沙门氏菌生长速度显著(P<0.05)低于对照组。月桂酸、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯对肠炎沙门氏菌均有一定的抑制作用，单辛酸甘油酯对肠炎沙门氏菌的抑菌效果最佳。

图3 不同中链脂肪酸甘油酯对肠炎沙门氏菌的抑菌作用

2.4 中链脂肪酸酯对鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用

由图4可得，在整个试验期，月桂酸组、单月桂酸甘油酯组、单辛酸甘油酯组鸡白痢沙门氏菌增殖显著(P<0.05)低于对照组。0～4 h，辛葵酸甘油酯组与对照组鸡白痢沙门氏菌生长速度一致且增长不显著，4～24 h，辛葵酸甘油酯组鸡白痢沙门氏菌增殖显著(P<0.05)低于对照组，24 h后，对照组相较于辛葵酸甘油酯组鸡白痢沙门氏菌有上升。月桂酸、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌均有一定的抑制作用，但存在作用时间的差异。

图4 不同中链脂肪酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用

3 讨论

中链脂肪酸和中链脂肪酸甘油酯都具有特定的营养和代谢作用，包括快速消化、被动吸收和强氧化，对幼小动物的营养有着重大的意义[12]。研究表明，中链脂肪酸可以通过胃黏膜被吸收，还因其能够穿透细菌的半透膜并破坏细胞内部结构而具有很强的抗菌活性[13]。Kitahara等[14]研究表示，月桂酸+庆大霉素和月桂酸+亚胺培南组合的作用与12种组合中的临床分离株具有协同作用。月桂酸抑菌效果未见报道，本实验结果显示，月桂酸对金黄色葡萄球菌有十分显著的抑制效果；而对肠炎沙门氏菌有较强的抑菌作用，对肠炎沙门氏菌出现了增殖前抑制。

中链脂肪酸甘油酯可以被完整地吸收进入肠上皮细胞，然后被微粒体脂肪酶水解[15]。中链脂肪酸单甘酯可以抗病原体，其作用效果要优于游离脂肪酸，特别是月桂酸甘油酯[6]。研究表明，日粮中添加中链甘油三酯可有效降低结肠和直肠中大肠埃希菌的数量[16]。中链脂肪酸单甘酯，尤其是月桂酸单甘酯，具有较强的抗菌和抗病毒的功能[16]。Lieberman等[17]综述了单月桂酸甘油酯具有抗多种病毒如艾滋病病毒、疱症病毒、流感病毒等的功能，以及对革兰氏阳性菌如葡萄球菌、链球菌等有很强的抑制作用。Fortuoso等[18]研究表明，在饲料中添加100～300 mg·kg-1月桂酸单甘酯可以显著降低肉鸡感染球虫和细菌的概率，同时显著改善饲料转化效率和肉品质。Kimsey等[19]研究表明，单月桂酸甘油酯可降低细菌芽孢的耐热性，抑制芽孢萌发和杀死芽孢。本实验结果显示，单月桂酸甘油酯对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌都有着较强的抑制效果。张佩华等[20]研究表明，食品级单辛酸甘油酯微乳液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的最低抑菌浓度均为135 mL·L-1，具有良好的抑菌特性。本试验结果显示，单辛酸甘油酯对肠炎沙门氏菌有极为显著的抑制效果，对金黄色葡萄球菌和鸡白痢沙门氏菌有较强的抑制效果。辛葵酸甘油酯的抑菌效果未见报道，本试验结果显示，辛葵酸甘油酯对金黄色葡萄球菌有着较强的抑制效果，对大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的抑制效果较弱。