朱义保 吴 斐 万 磊

子宫内膜异位症的发病机制有多种学说，其中免疫抑制因素也受到关注。近年来国内外研究发现，多数子宫内膜异位症患者的腹腔液和病灶均有调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)升高的现象[1-5]，认为免疫抑制参与了子宫内膜异位症的发生发展，Treg细胞升高形成免疫抑制，降低了机体清除盆腔异位细胞的能力，进而导致子宫内膜异位症的发生发展[6]。但是我们认为，子宫内膜异位症表现为炎症性疾病，患者腹腔表达许多炎症因子，Treg细胞上调可能是继发于炎症的免疫调节事件，与其诱导的炎症因子的升高有关。因此在本研究中，我们以子宫内膜异位症的巧克力囊肿患者为研究对象，以Treg细胞为免疫抑制的观察指标，比较经GnRH-a治疗和未经GnRH-a治疗患者腹腔液Treg细胞及与Treg细胞诱导有关的炎症因子水平，观察Treg细胞与其诱导的炎症因子的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2019年收治的41例子宫内膜异位症患者为研究对象，巧克力囊肿大小5～7 cm，其中16例术前经GnRH-a治疗、3个周期后来院手术的为治疗组，另25例未经GnRH-a治疗直接手术的为未治疗组，2组的囊肿大小、CA125、分期情况见表1。同时选25例子宫肌瘤患者为对照。纳入对象均排除心、肝、肾、内分泌疾病和盆腔感染疾病，近3个月未服用激素类药物。本研究通过医院伦理委员会批准。

表1 研究对象的基本情况

1.2 主要试剂及仪器

雌二醇检测试剂盒为雅培公司产品，流式细胞仪为BD公司产品，Treg细胞检测试剂盒购自Bio-Science 公司(内含抗人FITC-CD4 和PE-Foxp3单抗，及配套的固定透膜和透膜缓冲试剂)，IL-10、TGF-β、PGE-2 ELISA试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.3 治疗方法

术前经GnRH-a亮丙瑞林治疗的子宫内膜异位症患者，在月经周期的1～5天(28天为1个周期)，第1次皮下注射亮丙瑞林3.75 mg，部位为上臂或臀部，每1周期给药1次，剂量同第1次，连续给药3个周期。

1.4 检测方法

1.4.1 腹腔液取样 术前经GnRH-a治疗的子宫内膜异位症患者3个周期后入院手术，未经GnRH-a治疗的子宫内膜异位症和子宫肌瘤患者月经干净2～7天后入院手术，术中取腹腔液。

1.4.2 雌二醇和IL-10、TGF-β、PGE-2检测 雌二醇采用电化学发光免疫法检测，IL-10、TGF-β、PGE-2采用ELISA检测，相关操作按说明书进行。

1.4.3 Treg细胞检测 腹腔液离心取沉淀细胞，用1 ml PBS悬浮，取100 μL加入测定管，加10 μL FITC-CD4抗体，再加1 ml固定透膜液，混匀，室温避光孵育40 min，离心去上清，用透膜缓冲液100 μL重悬，加10 μL PE-Foxp3抗体，混匀，室温避光孵育30 min，离心去上清，用200 μL PBS重悬上机检测。

1.5 统计方法

用SPSS 19.0软件中的方差分析、T检验、卡方分析和Kruskal-Wallis秩和分析进行统计检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗组治疗前后、未治疗组、对照组的基础雌二醇水平

月经第3天的雌二醇值为基础水平，血清化学发光免疫检测显示，治疗组治疗后、治疗组治疗前、未治疗组、对照组的基础雌二醇分别为(11.6±4.9)ng/L、(34.8±8.7)ng/L、(39.4±12.4)ng/L、(33.7±9.5)ng/L(图1)。治疗组治疗后的基础雌二醇值相比治疗前明显下降，差异有统计学意义(t=9.29,P=0.00)，表明子宫内膜异位症患者经药物治疗后，基础雌二醇的水平显著下降，达到了药物绝经状态。治疗组治疗前、未治疗组和对照组的基础雌二醇差异无显著性(P>0.05)。

图1 3组基础雌二醇水平

2.2 治疗组治疗后、未治疗组、对照组腹腔液Treg细胞百分比

流式细胞检测显示，治疗组治疗后、未治疗组、对照组的Treg细胞百分比分别为2.94±0.83、5.32±1.16、2.05±0.59(图2)，未治疗组的Treg细胞百分比较对照组和治疗组高，差异有统计学意义(P<0.01)，表明子宫内膜异位症上调了Treg细胞。使用GnRH-a治疗后，治疗组雌二醇下降，同时Treg细胞百分比下降，提示雌二醇水平与Treg细胞百分比有关。治疗组治疗后和对照组的Treg细胞百分比差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。

图2 治疗组治疗后、未治疗组、对照组腹腔液Treg细胞百分比情况

2.3 治疗组治疗后、未治疗组、对照组腹腔液IL-10、TGF-β、PGE-2炎症因子水平

子宫内膜异位症患者腹腔液中存在许多炎症因子[7-8]，经GnRH-a治疗后Treg细胞下调，我们认为这可能和诱导Treg细胞的IL-10、TGF-β、PGE-2的下降有关，因此离心取腹腔液的上清，进一步实施了IL-10、TGF-β、PGE-2的检测。ELISA显示，IL-10在治疗组治疗后、未治疗组、对照组中的水平分别为18.26±4.53 ng/L、19.23±5.64 ng/L、20.56±5.21 ng/L，TGF-β在治疗组治疗后、未治疗组、对照组中的水平分别34.01±12.89 ng/L、75.14±16.86 ng/L、25.32±10.26 ng/L，PGE-2在治疗组治疗后、未治疗组、对照组中的水平分别22.49±4.65 ng/L、50.26±6.51 ng/L、16.34±6.43 ng/L(图3)，统计显示，未治疗组与治疗组治疗后、对照组相比，TGF-β、PGE-2明显更高，差异有统计学意义(P=0.00)，而IL-10在三者间差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。

图3 治疗组治疗后、未治疗组、对照组腹腔液IL-10、TGF-β、PGE-2炎症因子水平比较

3 讨论

子宫内膜异位症是一种妇科常见病，发病机制尚不清楚，可能与腹腔内环境有关，其中免疫因素的作用受到关注。研究发现[1-5]，多数子宫内膜异位症患者的腹腔液和病灶常伴Treg细胞的升高。

Treg细胞是机体重要的免疫抑制细胞，通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子，或和T效应细胞直接接触，发挥免疫抑制功能。研究认为[6]子宫内膜异位症患者病灶的Treg细胞升高，会形成局部免疫抑制，降低清除盆腔异位细胞的能力，进而导致子宫内膜异位症的发生发展。

但是我们认为，异位子宫内膜是由在位子宫内膜逆流而来，是机体的正常组成部分，子宫内膜在妊娠期间得到了母体激素的有效刺激，接触了自身免疫细胞，形成了免疫耐受，用局部的免疫抑制解释子宫内膜异位症的发生发展可能不合理。

GnRH-a是治疗子宫内膜异位症的药物，其机制是抑制垂体促性腺激素的分泌，导致卵巢分泌的性激素减少，造成体内低雌激素状态。结果显示，子宫内膜异位症患者确实上调了Treg细胞，未治疗组相比于对照组，Treg细胞百分比明显升高，但经过GnRH-a治疗后，伴随雌二醇的下降，治疗组的Treg细胞百分比也明显降低，而且，诱导Treg细胞的TGF-β、PGE-2的炎症因子也出现下降，因此我们认为子宫内膜异位症患者腹腔存在炎症，Treg细胞的上调可能与其诱导的炎症因子的升高有关。

研究发现，子宫内膜异位症表现为炎症性疾病，患者腹腔表达TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β、PGE-2等许多炎症因子[7-8]。对于炎症因子出现的原因，我们认为这与异位内膜出血引起的炎症有关，异位内膜出血后囊壁压力增大，反复形成破裂口，破裂后的囊内容物刺激腹膜和卵巢，形成炎症，周期性出血强化了这一作用，并一直持续，形成了永不愈合的伤口(此话原本是用来描述肿瘤的[9]，用来描述子宫内膜异位症可能更合适)。

然而，炎症激活之后，机体会实施免疫调节[10]，免疫抑制相伴发生，形成抗炎反应抑制炎症，炎症和抗炎相继出现、相伴发生，Treg细胞作为典型的免疫抑制抗炎细胞，这可能是子宫内膜异位症激活炎症后，Treg细胞随后上调的原因。

这一现象也见于肿瘤，研究显示肿瘤虽存在免疫抑制，但在使用免疫调节的CTLA-4、PD-1治疗后，只有少数患者有效，多数患者疗效不明显[11-13]，这一结果提示免疫抑制和肿瘤发生有一定关系，但关系可能不充分，究其原因，我们认为这可能也和免疫调节有关，肿瘤组织因为血管生长不协调，特别是生长较快的恶性肿瘤，不能及时供应营养，会出现缺氧或坏死，引起损伤性炎症，如出现TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TGF-β等[14-15]，炎症激活后实施免疫调节，免疫抑制出现，免疫抑制细胞继发性聚集，但这种免疫抑制细胞的聚集在肿瘤发生之后。肿瘤发生与免疫抑制之间的因果关系不充分，这可能是肿瘤在解除免疫抑制后，因多数肿瘤来源于自身，突变负荷量不大，肿瘤抗原不强，免疫治疗效果不明显的原因。

使用GnRH-a治疗子宫内膜异位症，雌激素下降，子宫内膜萎缩或凋亡，无周期性出血，炎症反应减弱，同时，抗炎反应也减弱，Treg细胞开始下降，这可能是使用GnRH-a治疗后，Treg细胞下降的原因。

综上所述，我们认为子宫内膜异位症Treg细胞的上调可能是继发于炎症的免疫调节事件，与其诱导的炎症因子有关。