王怡，陈袁伟

[1.南京大学医学院附属口腔医院（南京市口腔医院），江苏南京210008；2.同济大学附属口腔医院口腔颌面外科，上海200072]

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是最常见的头颈部肿瘤之一，是全球第六大最常见的癌症[1-2]，发病率高，易发生淋巴结转移且易复发[3-4]。虽然目前OSCC的临床诊断和治疗方法有所进步，但是患者的5年生存率并没有明显的改善[5]。在过去的几年中，越来越多的研究证实长链非编码RNA（lncRNAs）参与了癌症的进展，有一部分研究还建议将其作为癌症标志物[6]。lncRNAs是一类>200个碱基且不具有蛋白编码能力的RNA分子[7]，在细胞中具有多种功能，可以充当分子信号通过表观遗传，转录或转录后调节[8-9]。越来越多的证据表明lncRNAs在癌症细胞增殖、分化、凋亡和癌细胞转移过程中发挥了重要作用[10]。长链非编码RNA 尿路上皮癌相关基因1（lncRNA UCA1）在膀胱癌、乳腺癌和结直肠癌中异常表达，在多种肿瘤中发挥致癌作用，包括胶质母细胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等[11-14]。最近的研究也表明lncRNA UCA1参与了OSCC 的进展[15]，然而其在OSCC 中的相关分子机制研究还很少。本研究旨在探讨lncRNA UCA1靶向miR-206 调控YAP1基因对OSCC 细胞增殖和细胞凋亡的影响，初步阐明其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9 细胞均购自中国科学院上海细胞库。细胞培养相关试剂均购自美国Gibco 公司，Lipofectamine 3000 和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）相关试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，YAP1 一抗、二抗购自美国Cell Signaling Technology 公司，RNA 引物由北京擎科生物科技有限公司合成，UCA1、miR-206、YAP1、miR-206 mimics、miR-206 inhibitor 均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，流式细胞分析仪购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 细胞培养

将HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9细胞接种于含10%胎牛血清、青霉素（100 u/mL）、链霉素（100 μg/mL）的DMEM 培养基中，在5%二氧化碳、饱和湿度、37℃培养箱中培养，每2～3天传代1次。

1.3 采用Lipofectamine 3000进行细胞转染

将2×105个/mL密度的HN13细胞接种于6孔板中并生长浓度至60%，换用无血清培养基培养。取浓度为100 nmol/L的siUCA1（阴性对照为siNC）或50 nmol/L miR-206 mimics（阴性对照为mimics NC）或50 nmol/L miR-206 inhibitor（阴性对照为inhibitor NC）分别加入200 μL 无血清培基稀释，充分混匀，制成RNA 稀释液。在2 μL 的Lipofectamine 3000 中加入198 μL 无血清培养基稀释液体，充分混匀，制成Lipofectamine 3000 稀释液，室温静置5 min。将2 种稀释液充分混合，室温静置15 min，制备成转染复合物。将100 μL转染复合物滴加到含有1 mL无血清培养基的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。在5%二氧化碳、37℃培养箱内孵育6 h，换用正常培养基培养24 h 用于后续实验。控制组不做任何处理，对照组使用随机siRNA序列转染，实验组使用siUCA1转染。

1.4 qRT-PCR检测

采用TRIzol一步法提取细胞RNA，40 μL无核酸酶水溶解，置入-80℃冷冻保存。取0.5 μg 总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再行PCR 扩增目标基因。预先设计合成引物，将所得cDNA 加至PCR 反应体系中扩增目标片段。在待测样品中加入1 μL 模板、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、5 μL SYBR 探针和3 μL DEPC水避光混匀后，上机检测相关分子的表达。反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。GAPDH和U6作为内参，根据2-∆∆Ct法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

以2×103个/mL 细胞密度接种于96 孔板中，设置24 h、48 h、72 h 和96 h 4 个时间点，每组设5 个复孔，培养过夜使细胞贴壁。待每组细胞处理并在相应时间点，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h。最后在酶标仪450 nm 处测定吸光度（OD）值，重复3次，并绘制生长曲线。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

将各组细胞培养至正常生长阶段，转染48 h 后胰酶消化，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗涤，1 000 r/min离心5 min，收集细胞；用预冷PBS重悬细胞1次，1 000 r/min离心5 min，洗涤细胞；加入300 μL Binding Buffer 重悬细胞；再加入5 μL Annexin V-FITC混匀，避光，室温孵育15 min；加入5 μL PI 染色5 min，补加200 μL Binding Buffer。用FlowJo 10分析细胞凋亡比率。

1.7 双荧光素酶报告基因结合位点

使用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-206 与UCA1、YAP1的靶向结合位点。将含UCA1 序列连接至双荧光素酶载体pGL3，得到pGL3-UCA1-WT 载体。同时，通过定点突变将结合位点突变（MUT），构建突变质粒pGL3-UCA1-MUT。同理，构建pGL3-YAP1-WT 和pGL3-YAP1-MUT 质粒载体。将HN13 细胞接种于96 孔板中24 h，当细胞融合到50%～70%时，分别将UCA1-WT 或UCA1-MUT 质粒（YAP1-WT 或YAP1-MUT）与mimics NC 或miR-206 mimics 同时转染HN13 细胞。用双荧光素酶报告基因检测系统测定48 h 荧光素酶相对活性。分别验证UCA1、YAP1的结合位点。

1.8 Western blotting检测

将各组细胞培养至对数生长期并转染24 h，胰酶消化并收集细胞，1 000 r/min 离心5 min，PBS 洗涤，用RIPA 裂解液分离提取细胞样本中的全蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF 膜上，浸入含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）中，室温下摇床封闭2 h。加入YAP1一抗（1∶1 000），4℃共同孵育8 h。PBS洗涤3次，加入相应二抗（1∶5 000），震荡孵育2 h。洗膜后，加入化学发光试剂显色、胶片曝光。使用凝胶成像分析系统拍照，通过Image J软件计算YAP1蛋白灰度值。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞lncRNA UCA1、miR-206 mRNA 相对表达量比较

qRT-PCR 结果显示，HOK 细胞lncRNA UCA1 mRNA 相对表达量为（1.10±0.12）、TSCCA 细胞为（1.98±0.23）、SCCl5 细胞为（1.85±0.19）、HN13 细胞为（3.02±0.18）、CAL27 细胞为（2.32±0.15）、HSC3 细胞为（1.97±0.18）、SCC9 细胞为（2.59±0.15），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=37.580，P=0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9细胞均较HOK细胞升高（P<0.05）。

HOK 细胞miR-206 mRNA 相对表达量为（1.06±0.10）、TSCCA 细胞为（0.31±0.09）、SCCl5 细胞为（0.42±0.07）、HN13 细胞为（0.26±0.05）、CAL27 细胞为（0.38±0.08）、HSC3 细胞为（0.41±0.04）、SCC9 细胞为（0.40±0.13），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=32.070，P=0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9 细胞均较HOK 细胞降低（P<0.05）。其中HN13细胞miR-206 mRNA表达差异更显著，故选择该细胞株进行后续实验。

2.2 lncRNA UCA1促进OSCC细胞凋亡

qRT-PCR 结果显示，对照组lncRNA UCA1相对表达量为（1.05±0.08）、控制组为（1.05±0.10）、实验组为（0.21±0.07），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=99.991，P=0.000）。对照组与控制组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；对照组与实验组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明转染成功。

各组24 h、48 h、72 h 和96 h 的OD 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F=191.904，P=0.000）；②各组OD值有差异（F=27.801，P=0.000），实验组低于对照组；③各组的OD 值变化趋势有差异（F=9.042，P=0.000）。表明敲除lncRNA UCA1使细胞活力明显降低。见表2。

表2 各组不同时间点OD值比较（n=3，±s）

表2 各组不同时间点OD值比较（n=3，±s）

组别控制组对照组实验组24 h 0.19±0.05 0.21±0.03 0.21±0.05 48 h 0.32±0.04 0.31±0.03 0.25±0.03 72 h 0.50±0.04 0.51±0.03 0.35±0.03 96 h 0.88±0.10 0.99±0.13 0.56±0.06

流式细胞术结果显示，控制组凋亡率为（4.14±0.94）%、对照组为（4.04±1.46）%、实验组为（14.96±1.59）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=64.221，P=0.000）。对照组与控制组差异无统计学意义（P>0.05），实验组凋亡率较对照组升高（P<0.05），敲除lncRNA UCA1诱导细胞凋亡。见图1。

图1 3组NH13细胞凋亡率比较

2.3 lncRNA UCA1能够靶向miR-206

通过starBase 数据库预测lncRNA UCA1 与miR-206 存在结合位点，并构建了突变序列（见图2）。UCA1-WT 转染miR-206 mimics 荧光素相对活性为（0.48±0.08）、UCA1-MUT miR-206 mimics NC 为（1.04±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=7.849，P=0.001），UCA1-MUT 转染miR-206 mimics荧光素相对活性为（1.02±0.11），UCA1-MUT 转染mimics NC 为（1.01±0.19），经t检验，差异无统计学意义（t=0.395，P=0.713），UCA1-WT 荧光素酶相对活性被显著抑制（P<0.05），而UCA1-MUT 荧光素酶相对活性无显著变化（P>0.05），证实两者间的靶向结合关系。

图2 lncRNA UCA1与miR-206的结合位点

将对照组均分为对照组1 和对照组2，并分别转染siNC 和过表达空载体；将实验组均分为实验组1和实验组2，实验组1 和实验组2 分别转染siUCA1 和UCA1 过表达载体。qRT-PCR 结果显示，对照组1 miR-206 相对表达量为（1.02±0.07）、实验组1 为（2.34±0.23）、对照组2 为（1.06±0.09）、实验组2 为（0.22±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=131.527，P =0.000），实验组1 较对照组1 升高（P<0.05），实验组2较对照组2降低（P<0.05）。

2.4 YAP1是miR-206的靶基因

通过starBase 预测miR-206 与YAP1 存在结合位点，并构建了突变序列（见图3）。YAP1-WT 转染miR-206 mimics 荧光素相对活性为（0.42±0.07）、YAP1-MUT miR-206 mimics NC 为（1.03±0.10），经t检验，差异有统计学意义（t=8.398，P=0.001），YAP1-MUT 转染miR-206 mimics 荧光素相对活性为（1.03±0.10），YAP1-MUT 转染mimics NC 为（1.04±0.15），经t检验，差异无统计学意义（t=0.365，P=0.733），YAP1-WT mimics荧光素酶活性被抑制（P<0.05），而YAP1-MUT mimics 荧光素酶活性无显著变化（P>0.05），证实两者的靶向结合关系。

图3 miR-206与YAP1的结合位点

控制组不做任何处理，对照组1和对照组2分别转染mimics NC 和inhibitor NC，实验组1 和实验组2分别转染miR-206 mimics 和inhibitor。qRT-PCR 结果显示，对照组1 的miR-206 mRNA 相对表达量为（1.01±0.18）、对照组2 为（1.04±0.21）、实验组1 为（2.56±0.19）、实验组2 为（0.22±0.08）、控制组为（1.05±0.10），经方差分析，差异有统计学意义（F=84.583，P=0.000）。对照组1、对照组2与控制组比较，差异无统计学意义（P>0.05），实验组1 miR-206 mRNA 相对表达量较对照组1 显著升高（P<0.05），实验组2 较对照组2 显著降低（P<0.05），提示miR-206 mimics 和inhibitor 细胞转染有效。另外，对照组1 的YAP1 mRNA 相对表达量为（1.08±0.18）、对照组2 为（0.99±0.12）、实验组1 为（0.47±0.06）、实验组2 为（1.68±0.19）、控制组为（1.00±0.16），经方差分析，差异有统计学意义（F=25.662，P=0.000），实验组1 较对照组1 降低（P<0.05），实验组2 较对照组2 升高（P<0.05）。Western blotting 检测结果显示，对照组1 的YAP1 蛋白相对表达量为（0.58±0.08）、对照组2 为（0.59±0.05）、实验组1 为（0.31±0.04）、实验组2 为（0.84±0.06）、控制组为（0.59±0.09），经方差分析，差异有统计学意义（F=28.324，P=0.000），实验组1 较对照组1降低（P<0.05），实验组2较对照组2升高（P<0.05）（见图4）。

图4 各组YAP1蛋白的表达

2.5 lncRNA UCA1 通过miR-206/YAP1 促进OSCC细胞的增殖并抑制凋亡

为进一步验证该信号机制，笔者在细胞中转染siUCA1 的同时转染miR-206 inhibitor，对照组不做处理，实验组1 转染siUCA1，实验组2 转染siNC 和miR-206 inhibitor 的阴性对照，实验组3 转染siUCA1和miR-206 inhibitor。对照组miR-206mRNA 相对表达量为（1.05±0.11）、实验组1为（2.45±0.15）、实验组2 为（2.37±0.25）、实验组3 为（1.16±0.12），经方差分析，差异有统计学意义（F=62.351，P=0.000），实验组1较对照组升高（P<0.05），促进了miR-206 的表达；实验组3 较实验组2 降低，抑制了miR-206 的表达（P<0.05）。对照组YAP1 mRNA 相对表达量为（1.09±0.16）、实验组1 为（0.45±0.07）、实验组2 为（0.43±0.08）、实验组3 为（0.96±0.13），经方差分析，差异有统计学意义（F=24.863，P =0.000），实验组1 较对照组降低（P<0.05），抑制YAP1 mRNA 的表达，实验组3较实验组2 升高（P<0.05），恢复YAP1 的表达。Western blotting 检测结果显示，对照组YAP1蛋白相对表达量为（0.67±0.08）、实验组1为（0.42±0.06）、实验组2 为（0.43±0.10）、实验组3 为（0.74±0.10），经方差分析，差异有统计学意义（F=11.503，P=0.003），实验组1 YAP1 蛋白相对表达量较对照组降低（P<0.05），抑制YAP1 蛋白的表达，实验组3 较实验组2 升高，恢复了YAP1蛋白的表达（P<0.05）（见图5）。

图5 各组YAP1蛋白表达

各组24 h、48 h、72 h、96 h 的OD 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD值有差异（F=232.034，P=0.000）；②各组的OD 值有差异（F=24.691，P=0.000）；③各组的OD值变化趋势有差异（F=8.123，P=0.000）（见表3）。流式细胞术结果显示，对照组细胞凋亡率为（4.14±1.04）%、实验组1 为（14.14±1.49）%、实验组2为（14.54±1.81）%、实验组3为（6.06±1.67）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=37.312，P=0.000）。实验组1细胞凋亡率较对照组升高（P<0.05），实验组3 较实验组2 降低（P<0.05）（见图6）。

表3 各组不同时间点OD值比较（n=3，±s）

表3 各组不同时间点OD值比较（n=3，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与实验组2比较，P<0.05。

组别对照组实验组1实验组2实验组3 96 h 0.93±0.06 0.58±0.06①0.56±0.10 0.86±0.08②24 h 0.19±0.05 0.21±0.04 0.21±0.04 0.22±0.03 48 h 0.32±0.03 0.27±0.04 0.25±0.03 0.30±0.03 72 h 0.52±0.06 0.36±0.05①0.35±0.07 0.51±0.05②

图6 各组NH13细胞流式细胞图

3 讨论

近年来，越来越多的研究证实了lncRNAs 通过调控细胞的增殖、分化、迁移侵袭等生物学进程参与癌症的进展[10]。目前发现多种lncRNA 在OSCC 中表达有差异， lncRNA HOXA11-AS、lncRNA AC007271.3 和lncRNA CASC9 等在OSCC 中高表达从而促进OSCC 细胞增殖，抑制凋亡，加速OSCC 的进展[16-18]。现今lncRNA UCA1已经被报道在胶质母细胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等癌症中发挥致癌作用[11-14]。而少有的几篇关于lncRNA UCA1在OSCC 中的研究证实了其在OSCC中表达升高，并能够促进细胞增殖和增强耐药性[15，19-20]。本研究结果与其一致，证实lncRNA UCA1在OSCC细胞中的表达水平显著高于人正常口腔角质细胞，通过抑制lncRNA UCA1表达能够显著阻碍细胞增殖并促进细胞凋亡。并且通过生物信息学预测结果与实验验证发现lncRNA UCA1通过miR-206/YAP1 促进OSCC 进展的分子机制，这是不同于先前报道的新发现。

miRNAs也是一种非编码RNA且高度保守，长度只有20～25 个核苷酸，能通过与靶基因mRNA 结合调控蛋白表达，参与多种细胞生物学过程[21]。已有文献证实miRNAs能够参与各种疾病的进展，尤其是癌症[22]。其中，miR-206 在癌症中作为一种抑癌因子，通常抑制癌症进展，这已在非小细胞肺癌[23]、前列腺癌[24]、甲状腺癌[25]和宫颈癌[26]等研究中得到证实。目前关于miR-206 在OSCC 中的功能尚不清楚，而本研究证实miR-206 在OSCC 细胞中表达水平显著降低，其作为肿瘤抑制因子发挥作用，这与miR-206在其他癌症中的研究结果相一致。并且本研究结果证实miR-206能够与lncRNA UCA1互补结合，其表达被lncRNA UCA1调控，并进一步影响下游基因表达。而通过转染miR-206 inhibitor 抑制miR-206 的表达能够逆转siUCA1 的功能，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。此外，本研究结果证实了miR-206 是通过调控YAP1蛋白的表达水平实现对癌细胞生物学过程的调控。

YAP1表达水平升高往往促进癌症的进展，相关研究表明YAP1能够促进结直肠癌上皮间质转化和血管生成[27]，在乳腺癌[28]、甲状腺癌[29]和胰腺导管癌[30]中都具有促癌作用。有研究表明，YAP1 同样也在OSCC 中发挥了促癌作用，对其抑制能够显著抑制癌症进展[31-33]，本研究结果与以上结果一致，YAP1 能够促进OSCC 细胞增殖，抑制凋亡。本研究还证实YAP1是miR-206 的1 个靶基因，其表达受到miR-206的调控，而lncRNA UCA1能够通过miR-206间接调控YAP1 的表达，从而影响OSCC 细胞的增殖、凋亡，参与OSCC 的进展。本研究结果显示了敲除lncRNA UCA1后，YAP1 蛋白表达水平显著下降，同时细胞活力显著降低，凋亡细胞显著增多。本研究通过敲除lncRNA UCA1在OSCC中的表达，证实了其促癌作用，并生物信息学预测结果和双荧光素酶验证了miR-206和lncRNA UCA1、YAP1 间的靶向结合关系，进一步实验验证了三者在OSCC中的相互作用及对OSCC进展的影响。

综上所述，本研究阐明了lncRNA UCA1在OCSS中通过靶向miR-206调控YAP1的表达，介导OSCC细胞增殖和凋亡，这一分子机制的发现为OSCC的诊断和治疗提供了新思路。然而，鉴于lncRNAs的多功能靶向作用，lncRNA UCA1在OSCC 中更详细的分子机制还有待进一步探索，对其在临床诊断治疗中的应用还需更多的研究和论证。