李卿，李轶君，张国锐

食管癌起病隐匿，早期可无症状，手术切除是治疗食管癌最主要的手段，但患者手术后仍可发生肿瘤复发转移，以致死亡［1-2］。该病重在早期诊断，而目前尚缺乏可靠、准确的分子标志物。因此，探索食管癌发生的相关分子机制，寻找新的早期诊断标志物成为食管癌研究的重点和难点。研究表明，miR-25 在肿瘤中异常表达，能影响乳腺癌［3］、肺癌［4］、胃癌［5］、肝癌［6］等多种肿瘤的进展，但在食管癌中的报道少见。盐诱导激酶1（salt-inducible kinase 1，SIK1）是一种蛋白编码基因，在细胞生长、细胞周期、代谢、机体稳态等方面发挥关键作用［7-10］。本研究通过检测食管癌组织和癌旁组织中miR-25的表达差异，探讨过表达和干扰miR-25表达通过SIK1影响食管癌细胞侵袭和迁移的机制，并进一步验证外泌体来源的miR-25能否作为食管癌无创诊断的标志物，为食管癌的早期诊断和优化治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床标本 收集2015 年1 月—2020 年6 月在湖南省郴州市第一人民医院胸心外科行手术治疗的食管癌患者，选择经病理或消化内镜诊断明确的处于早期（0～Ⅰ期）的原发性食管癌54例，所有患者术前均未进行放疗、化疗以及其他辅助治疗。手术切除的癌组织和癌旁组织标本均于-80 ℃低温冰箱中冻存备用。按照1∶1配对原则，选择性别匹配、年龄相差5 岁且无胃肠道疾病的体检健康者54 例作为对照。本研究经本院伦理学委员会批准，所有研究对象知情并签署知情同意书。

1.2 实验材料 人食管癌细胞EC109 购于国家生物医学实验细胞资源库；DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒、4%多聚甲醛固定液、细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Matrigel基质胶购于美国BD公司；lipofectamine 3000试剂盒购于美国赛默飞公司；鼠源GAPDH 一抗、兔源SIK1一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、ECL化学发光底物、TRIzol 法RNA提取试剂盒、pcDNA 3.1 和pmirGLO 质粒均购于生工生物工程股份有限公司；miRNA 逆转录试剂盒、荧光定量PCR（qPCR）试剂盒购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；PCR引物序列由北京天一辉远生物科技有限公司合成；双荧光素报告酶试剂盒购于美国Promega 公司。多功能酶标仪（Multiskan FC）购于美国赛默飞公司，SDS-PAGE 电泳仪（DYCZ-24DH）购于北京六一仪器厂；CO2细胞培养箱（MCO-18AC）购于上海天呈科技有限公司；qPCR仪（ABI 7500）购于美国ABI 公司；倒置显微镜（YKDZ-400）购于上海永科光学仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2FD）购于苏洁医疗器械有限公司；高速冷冻离心机（Optima XPN）购于美国贝克曼库尔特公司；透射电镜（JEOL JEM-2800）购于日本电子株式会社。

1.3 qPCR检测miR-25表达 根据说明书要求，TRIzol法提取癌组织及癌旁组织总RNA，逆转录成cDNA 后进行荧光定量PCR。PCR 引物序列见表1。反应体系：SYBR premix 10 µL，PCR 上、下游引物各 1 µL，DNA 模板 1 µL，ddH2O 7 µL，总体积20 µL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火25 s，共40 个循环。miRNA 的相对表达水平用U6进行标准化，相对表达量用2-ΔΔCt法进行计算。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 过表达和沉默miR-25对EC109细胞生物学行为的影响

1.4.1 细胞培养 将EC109 细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到80%左右进行传代培养，取处于对数生长期且状态良好的细胞进行后续实验。

1.4.2 细胞转染 EC109细胞接种于6孔板中，预培养12 h，待细胞融合度达到70%左右后将培养基更换成无血清、无双抗的DMEM 培养基。按照lipofectamine 3000 试剂盒的操作说明进行转染。转染组包含：miR-25 过表达组（miR-25 mimic 组）、过表达对照组（NC mimic 组）、miR-25 干扰组（miR-25 inhibitor 组）和干扰对照组（NC inhibitor 组）。NC mimic、miR-25 mimic、NC inhibitor 和 miR-25 inhibitor 均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。转染完成后按照1.3中方法检测miR-25表达，以确定转染效率。

1.4.3 Transwell 检测细胞的迁移和侵袭能力 Transwell 小室用基质胶预先孵育2 h，期间将转染48 h 的细胞用胰蛋白酶消化。用不含血清和双抗的DMEM 培养基将细胞稀释为5×105个/mL，取100 µL 细胞悬液加入到Transwell 小室上室中，将 Transwell 小室置于 24 孔板中，下室加入 600 µL 含有20% 胎牛血清的DMEM 培养基，继续培养24 h。取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫室温下染色15 min，最后用脱脂棉球轻轻擦去Transwell上室中未发生侵袭的细胞。细胞迁移实验则直接将消化后的细胞稀释至 5×105个/mL，取 100 µL 细胞悬液加入到 Transwell 上室中，然后在下室中同样加入600 µL 含有20%胎牛血清的DMEM 培养基，24 h 后对上室中的细胞进行固定染色。将Transwell小室晾干后置于显微镜下拍照，并分别计算细胞侵袭和迁移的数量，实验重复3次。

1.5 miR-25的靶基因预测及验证

1.5.1 Targetscan 数据库预测miR-25 的靶基因 使用Targetscan 数据库（http://www.targetscan.org/vert_71/）预测miR-25的潜在靶点是否包含SIK1基因。

1.5.2 Western blot 实验 取转染后的4组细胞，加入适量蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。对样品进行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白分离后转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h。用含1%吐温20 的TBS 洗膜，加入一抗（1∶5 000）于4 ℃孵育过夜，随后用二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1.5 h。使用增强型化学发光检测试剂盒进行显影，用凝胶成像仪捕获条带图像，然后用Image J 软件进行半定量分析。以GAPDH 作为内参，实验独立进行3次。

1.5.3 双荧光素酶报告实验 将SIK1 的野生型和突变型序列分别克隆到pmirGLO 质粒上。miR-25 mimic 和miR-25 inhibitor与SIK1 3'UTR野生型和突变型质粒共转染至EC109细胞，并以各自NC序列作为对照。48 h后，使用双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性。

1.6 Transwell 检测 miR-25 靶向 SIK1 对 EC109 细胞迁移和侵袭能力的影响 EC109 细胞分为pcDNA 3.1 组、SIK1 过表达组和miR-25+SIK1 过表达组。分组转染后Transwell 实验检测miR-25 靶向SIK1 对EC109 细胞侵袭和迁移能力的影响，实验步骤同1.4.3。

1.7 血浆外泌体的提取及miR-25 表达水平检测 将54 例食管癌患者和健康对照者的血浆样本300×g离心10 min，2 000×g离心 15 min，以去除细胞碎片，然后 12 000×g离心30 min，去除上清液，得到外泌体。使用0.22µm的过滤器进行过滤除菌，最后适量磷酸盐缓冲液重悬浮。外泌体提取后参照1.3中实验步骤检测miR-25的表达量，并分析食管癌患者癌组织与血浆外泌体中miR-25表达的相关性。

1.8 统计学方法 采用graphpad prism 8.0.3 软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组织和癌旁组织中miR-25表达水平比较 食管癌组织中miR-25 相对表达水平高于癌旁组 织（6.00±3.34vs.1.49±0.78，t=9.665，P＜0.01），见图1。

Fig.1 qPCR detection of the relative expression level of miR-25 in esophageal cancer tissues and adjacent tissues图1 qPCR检测miR-25在食管癌组织和癌旁组织中的相对表达水平

2.2 miR-25在EC109细胞中的转染效率 转染48 h后，miR-25 mimic 组 miR-25 表达水平较 NC mimic组上调约 8.40 倍（t=18.700，P＜0.01），而 miR-25 inhibitor 组 miR-25 表达水平较 NC inhibitor 组下调约33.6%（t=10.220，P＜0.01），见图2。

Fig.2 Overexpression and interference efficiency of miR-25 in EC109 cells detected by qPCR图2 qPCR检测miR-25在EC109细胞中的过表达和干扰效率

2.3 过表达和敲低miR-25 对EC109 细胞侵袭和迁移的影响 Transwell 实验显示，与NC mimic 组相比，miR-25 mimic 组侵袭和迁移的细胞数增多（P＜0.05）。miR-25 inhibitor 组中侵袭和迁移的细胞数较NC inhibitor组下降（P＜0.05），见图3、表2。

Fig.3 Migration and invasion of EC109 cells after overexpression and knockdown of miR-25 were detected by Transwell assay(×100)图3 Transwell实验检测过表达和敲低miR-25后EC109细胞的迁移和侵袭能力（×100）

Tab.2 Effects of overexpression and knockdown of miR-25 on migration and invasion of EC109 cells表2 过表达和敲低miR-25的各组EC109细胞迁移和侵袭能力变化 （n=3，个/视野，）

Tab.2 Effects of overexpression and knockdown of miR-25 on migration and invasion of EC109 cells表2 过表达和敲低miR-25的各组EC109细胞迁移和侵袭能力变化 （n=3，个/视野，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别NC mimic组miR-25 mimic组t细胞侵袭数73.0±6.9 93.0±5.9 3.794＊细胞迁移数69.3±3.2 87.4±2.1 8.153＊＊组别NC inhibitor组miR-25 inhibitor组t细胞侵袭数73.6±7.4 36.7±5.4 6.947＊＊细胞迁移数72.7±3.1 39.1±5.9 8.770＊＊

2.4 miR-25 的靶基因的预测和验证 通过Targetscan 数据库预测发现 SIK1 为 miR-25 的靶基因，见图 4。Western blot 结果显示 miR-25 过表达后，SIK1 的相对蛋白表达量较NC mimic 组下降（0.25±0.07vs.0.92±0.08，t=11.680，P＜0.01）。敲低miR-25后SIK1的蛋白表达量较NC inhibitor 组升高（0.79±0.05vs.0.44±0.08，t=6.369，P＜0.01），见图5。

Fig.4 Targetscan database predicts the 3'UTR binding of miR-25 to SIK1图4 Targetscan预测miR-25与SIK1的3'UTR结合

Fig.5 The effect of overexpression and knockdown of miR-25 on the expression of SIK1 detected by Western blot assay图5 Western blot检测过表达和敲低miR-25对SIK1表达量的影响

2.5 双荧光素酶报告实验 结果显示，miR-25 mimic 与SIK1 3'UTR 野生型质粒共转染后，细胞荧光素酶活性降低（P＜0.01），见图6。而miR-25 inhibitor 与 SIK1 3'UTR 野生型质粒共转染 EC109 细胞后，荧光素酶活性升高（P＜0.01），见图7。

Fig.6 Double luciferase reporter assay confirmed the change of luciferase activity after the simultaneous action of miR-25 mimic and SIK1 3'UTR图6 双荧光素报告酶实验验证miR-25 mimic与SIK1 3'UTR同时作用后荧光素酶活性的变化

Fig.7 Double luciferase reporter assay confirmed the change of luciferase activity after the simultaneous action of miR-25 inhibitor and SIK1 3'UTR图7 双荧光素酶报告实验验证miR-25 inhibitor与SIK1 3'UTR同时作用后荧光素酶活性的变化

2.6 miR-25通过靶向SIK1促进EC109细胞的侵袭和迁移 Transwell 实验显示，与pcDNA 3.1 组相比，SIK1 过表达组EC109 侵袭和迁移的细胞数量减少，而miR-25+SIK1过表达组EC109侵袭和迁移的细胞数量较SIK1过表达组增多，见图8、表3。

Fig.8 Transwell experiment verified that miR-25 promoted the invasion and migration of EC109 through SIK1(×100)图8 Transwell实验验证miR-25通过SIK1促进EC109的侵袭和迁移（×100）

Tab.3 Effects of SIK1 overexpression on migration and invasion of EC109 cells表3 SIK1过表达各组对EC109细胞迁移和侵袭的影响（n=3，个/视野，）

Tab.3 Effects of SIK1 overexpression on migration and invasion of EC109 cells表3 SIK1过表达各组对EC109细胞迁移和侵袭的影响（n=3，个/视野，）

＊＊P＜0.01。

组别pcDNA3.1组SIK1过表达组miR-25+SIK1过表达组F细胞侵袭数97.5±6.6 46.7±6.6a 67.8±8.1ab 38.280＊＊细胞迁移数72.5±2.2 33.2±3.9a 59.9±8.0ab 43.320＊＊

2.7 食管癌患者和健康对照血浆外泌体中miR-25的相对表达量 食管癌患者血浆外泌体中miR-25的相对表达量高于健康对照（t=8.534，P＜0.01），与在食管癌组织中的表达趋势一致，见图9。

Fig.9 qPCR detection of miR-25 expression in esophageal cancer and healthy human plasma exosomes图9 qPCR检测食管癌和健康人血浆外泌体中miR-25的表达量

2.8 miR-25 在食管癌组织和血浆外泌体中的表达相关性 外泌体中miR-25 的相对表达量与食管癌患者组织中的相对表达量呈正相关（r=0.767，P＜0.01），见图10。

Fig.10 Correlation of miR-25 expression in esophageal cancer tissue and plasma图10 miR-25在食管癌组织和血浆中的表达相关性

3 讨论

食管癌是原发于食管的恶性肿瘤，好发于中老年男性。食管癌患者早期治疗预后较好，但患者整体生存率仍然较低，究其原因主要是发现食管癌时患者多已处于中晚期，导致治疗后容易复发［11-12］。因此，迫切需要寻找新的食管癌诊断标志物以早期诊断，从而改善食管癌患者预后。

外泌体是一种直径在50～150 nm 的细胞外囊泡，广泛存在于各种体液中。外泌体是脂质双分子层，能够保护囊泡内的miRNA 不被RNA 酶降解，从而保证miRNA 浓度稳定。外泌体的内容物可反映母体细胞的特性，因此外泌体在肿瘤等疾病的诊断、预后预测等方面具有较大潜力［13］。外泌体来源的miRNA 能够作为前列腺癌、结肠癌的无创的诊断标志物［14-15］，能否作为食管癌早期诊断的生物标志物仍不明确。研究表明，miR-25能够参与多种肿瘤的进展，主要包括促进肿瘤的增殖、转移与侵袭［16］，抑制肿瘤细胞凋亡［17］，调控细胞周期［18］及自噬［19］等。在本研究中，笔者首先通过临床标本检测发现miR-25 在食管癌组织中的表达量高于癌旁组织，与Liu等［20］研究结果一致。进一步研究发现，过表达miR-25 后，EC109 细胞侵袭和迁移能力明显增强，说明miR-25可能参与了食管癌的进展。随后，本研究通过双荧光素酶报告实验证实SIK1是miR-25的靶基因。既往有研究表明，SIK1 活化可以促进p53 相关细胞失巢凋亡，并抑制细胞的克隆性生长［21］，且SIK1 表达降低与乳腺癌［21］、胰腺癌［22］、肝细胞癌［23］和卵巢癌［24］的进展、转移和不良预后有关。因此，SIK1被认为是抑癌基因。然而，SIK1在食管癌中的表达状况及其临床意义尚不清楚。本研究证实，过表达SIK1能够抑制食管癌EC109细胞侵袭和迁移，而miR-25靶向抑制SIK1表达后，EC109细胞侵袭和迁移能力较过表达SIK1 组升高，提示miR-25 可能是通过影响SIK1 的表达来调节EC109 细胞的生物学特性。最后，笔者发现食管癌患者血浆外泌体中的miR-25表达水平明显高于健康人群，且与食管癌组织中的表达量呈正相关，提示外泌体miR-25可能作为食管癌早期诊断的生物标志物。

本研究证实，miR-25可能通过外泌体分泌到外周血中发挥生物学功能，具有早期诊断食管癌的潜力。后续将纳入其他分期的食管癌标本，研究不同分期的食管癌中miR-25的表达趋势，同时进一步挖掘miR-25 在食管癌中发挥的其他功能以及与SIK1相关的信号通路，以期明确其具体作用机制。