陈梦雪，高波，边安政，邵馨乐，王文东

淄博市妇幼保健院，山东 淄博 255000

产后身痛，又称“产后关节痛”“产后风”“产后痹”“产后风湿”等，是指产妇在产后出现肢体或关节沉重、疼痛、酸胀、屈伸不利等症状[1-2]。该病临床症状复杂多变，除常见的四肢关节肌肉不适症状外，还可合并有心烦失眠、自汗盗汗、畏寒乏力等症状，相关实验室检验及影像学检查结果多未见异常[3]，因症状表现缺乏特异性而常常被临床忽视。该病症状较轻的患者经适当调养多预后良好，但少数症状较重的患者可因治疗不及时导致经久不愈，给患者生理及心理造成巨大伤害[4]。现代医学认为，本病起病可能与雌激素水平急剧变化、骨质疏松、自身免疫性因素、骶髂关节紊乱、产后耻骨分离等多种因素有关[5]。目前，也有西医学者认为本病多为产后抑郁导致的功能性风湿病，采用抗焦虑抑郁药物治疗[6]。

黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略》，具有益气温经、活血通痹、止痛的功效。临床研究证实，本方加减治疗产后身痛具有很好的疗效[7-8]。产后身痛因生产过程中真元大损，气血空虚，发病多以气血亏虚为本，《素问·调经论》载：“气血不和，百病乃变化而生。”国医大师周仲瑛教授认为，气虚亏虚为发病基础，在此基础上的营卫不和为发病的关键，故临床上多用黄芪桂枝五物汤加减以补益气血、调和营卫。黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的相关机制并不明确，因其药物成分较多、靶点作用过程复杂，具体基础实验研究的开展存在困难。故本研究希望能通过网络药理学的方法分析黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的作用靶点和通路，将其多成分、多靶点的复杂药理学作用机制通过直观的图像及数值体现出来，为后续相关研究的开展提供参考。

1 资料与方法

1.1 黄芪桂枝五物汤活性成分收集和活性成分靶点筛选在TCMSP数据库[9](http：//tcmspw.com/tcmsp.php)以“黄芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大枣”为关键词检索化合物的有效成分和基本信息，筛选满足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug likeness，DL)≥0.18[10]的化合物成分及其相关靶点。将相关靶点带入Uni-Prot数据库[11](https：//www.uniprot.org)筛选人源靶点以及标准化靶点信息，将每种成分对应的靶点信息通过EXCEL软件以表格形式保存。

1.2 产后身痛相关靶点筛选以“postpartum pain”“girdle pain”“low back pain”“pelvic girdle pain”“lumbopelvic pain”“postpartum chronic pain”“sacroiliac joint pain”等为关键词在OMIM数据库[12](https：//omim.org)检索及合并去重后获得产后身痛相关疾病靶点。

1.3 构建“药物-成分-靶点”和“疾病-靶点”网络关系图分别建立单位药活性成分与活性成分作用靶点、疾病与疾病靶点的相互作用关系，并分别将其导入Cytoscape 3.7.1软件构建相应网络关系图，利用该软件中的“Network Analyzer”工具对该网络图进行分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建与拓扑学分析利用STRING数据库[13](https：//string-db.org)分别检索活性成分靶点与疾病靶点基本数据及其关系，设置置信度>0.7[14]，物种为“智人(homo sapiens)”得到PPI关系数据结果，将结果借助Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络，运用该软件中的“Network Analyzer”工具对该网络图进行分析。

1.5 PPI网络合并及关键靶点基因筛选运用Cytoscape 3.7.1软件中Merge功能，将黄芪桂枝五物汤活性成分靶点的PPI网络与相关疾病靶点的PPI网络合并取交集获得药物作用潜在靶点[15]。

1.6 基因本体功能(gene ontology，GO)与京都基因与基因百科全书通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析运用DAVID 6.8数据库(https：//david.ncifcrf.gov)，物种设置为“智人(homo sapiens)”，进行GO生物学过程富集分析和KEGG代谢通路富集分析，获取生物学过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)[16]和通路分析的数据，以图表形式输出。

1.7 活性成分与靶点分子对接在RCSB PDB数据库[17](https：//www.rcsb.org)与Uni-Prot数据库中检索关键靶点并下载结构文件，在pubchem数据库[18](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下载关键化合物的结构文件。将结构文件导入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools软件进行处理后进行分子对接，结构由PyMol 2.4.0软件进行可视化处理，了解靶点蛋白质与活性成分的结合方式。

2 结果

2.1 黄芪桂枝五物汤活性成分筛选通过TCMSP数据库，设置OB≥30%，DL≥0.18为筛选标准，共筛选出63个有效成分，相关信息见表1，由于化合物数量过多，表中仅展示OB值前15位的活性成分信息。

表1 黄芪桂枝五物汤主要活性成分

2.2 黄芪桂枝五物汤“药物-成分-靶点”网络关系图的构建黄芪桂枝五物汤的活性成分在TCMSP数据库中预测的靶点共1 099个，去重后得到靶点229个。将药物、活性成分和预测靶点的信息导入Cytoscape 3.7.1软件，构建“药物-活性成分-靶点”网络，见图1。图1中三角形节点代表药物，椭圆形节点代表药物成分，椭圆形节点颜色表示不用药物来源，矩形节点代表成分相关靶点，线代表疾病与作用靶点之间的联系。根据Degree值大小筛选出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)等为药物作用的关键化合物。

图1 黄芪桂枝五物汤“药物-成分-靶点”网络关系图

2.3 黄芪桂枝五物汤“疾病-靶点”网络关系图的构建在OMIM数据库中检索去重后共得到376个与产后身痛疾病相关的靶点。将疾病和预测靶点的信息导入Cytoscape 3.7.1软件，构建“疾病-靶点”网络，见图2。图2中菱形节点代表与产后身痛相关的疾病，矩形节点代表与疾病相关的作用靶点，线代表疾病与作用靶点之间的联系。

图2 黄芪桂枝五物汤“疾病-靶点”网络关系图

2.4 PPI网络构建和拓扑学分析

2.4.1 活性成分作用靶点PPI网络将229个化合物靶点输入STRING数据库中，将置信度设为0.7，蛋白相互关联度为20，得到PPI关系文本和关系表格，将其导入Cytoscape 3.7.1软件并绘制PPI网络，见图3。网络中共246个靶点基因相互作用，1 613 条线表示各靶点蛋白间相互作用关系。以节点大小及颜色反映靶点的Degree值大小，线的粗细表示combine score值的大小。

图3 活性成分作用靶点的PPI网络图

2.4.2 疾病靶点的PPI网络操作方法同上，得到疾病靶点的PPI网络，见图4。网络中共136个靶点基因相互作用，237条线表示各靶点蛋白间相互作用关系。以节点大小及颜色反映靶点的Degree值大小，线的粗细表示combine score值的大小。

图4 疾病靶点的PPI网络图

2.5 PPI网络合并及关键靶点基因筛选运用Cytoscape 3.7.1软件中Merge功能，将黄芪桂枝五物汤活性成分靶点的PPI网络与相关疾病靶点的PPI网络合并取交集得到10个潜在靶点蛋白，分别为组织型纤溶酶原激活剂、干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1，IRF1)、纤溶酶原激活剂抑制剂1、氧化低密度脂蛋白受体1(oxidized low density lipoprotein receptor 1，OLR1)、载脂蛋白B-100(Apolipoprotein B-100，APOB)、中性粒细胞胞质溶胶因子1(neutrophil cytosol factor 1，NCF1)、核转录因子κB抑制剂alpha (nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，NFKBIA)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、信号转导和转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、转录因子p65(简称RELA)。其中，Degree值较大的靶点为STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA。

2.6 GO和KEGG富集分析结果

2.6.1 GO功能富集分析利用DAVID 6.8数据库进行GO功能富集分析，对合并网络后的10个靶点蛋白在基因功能中的作用进行研究，以P<0.05为筛选标准，共得到BP 23个、MF 5个、CC 5个。其中，黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的生物过程中位于前列的有RNA聚合酶II启动子的转录正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 signaling pathway)、凋亡过程(apoptotic process)、白细胞介素-12生物合成过程的正向调节(positive regulation of interleukin-12 biosynthetic process)、对病毒的防御反应(defense response to virus)；分子功能主要有蛋白结合(protein binding)、转录因子活性RNA聚合酶II核心启动子序列特异性(transcription factor activity，RNA polymerase II core promoter sequence-specific)、酶结合(enzyme binding)、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、NF-κB结合(NF-kappaB binding)；细胞成分主要有细胞液(cytosol)、I-κB/NF-κB复合物(I-kappaB/NF-kappaB complex)、核染色体(nuclear chromatin)、细胞质(cytoplasm)、细胞外间隙(extracellular space)。具体结果见图5、表2。由于筛选所得生物学过程条目较多，故根据P值排序，故仅选取P值最显著的前5个条目以图表形式表现。

图5 预测靶点的GO分析图

表2 黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的相关GO富集分析条目

2.6.2 KEGG通路富集分析将10个靶点导入DAVID 6.8数据库进行KEGG通路富集分析，以P<0.05为筛选标准，共得到13条通路，见表3、图6。并绘制出主要通路图，见图7。图7通路为破骨细胞分化，图中的矩形节点代表某一基因(蛋白质)，白色节点代表通路蛋白，绿色代表黄芪桂枝五物汤的关键作用靶蛋白STAT1、RELA、NFKBIA、NCF1，实线箭头代表激活，虚线箭头代表间接关系，两个箭头中间带圈的表示表达。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

图7 KEGG通路-破骨细胞分化图

表3 黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的相关KEGG通路分析

2.7 关键靶点与靶蛋白的分子对接结果将黄芪桂枝五物汤药物关键活性成分和关键靶点进行分子对接，判断其进入机体后能否与靶蛋白稳定结合。对接结果见表4，关键活性成分与关键靶点对接的亲和力均小于-5.0 kj·mol-1[19]，结果表明，黄芪桂枝五物汤药物关键靶点与靶蛋白有很好的结合性，研究的预测较为可靠。其中，山奈酚与RELA结合亲和力最强，可视化分析结果见图8。山奈酚化学结构用绿色表示，其他是RELA靶蛋白结构，TYR-285和UIS-252都是附近氨基酸残基的名称，由图可见，山奈酚与活性位点附近的TYR-285和 UIS-252形成氢键结合到RELA。

表4 黄芪桂枝五物汤化合物与关键靶点对接信息表

图8 山奈酚-RELA分子对接构象图

3 讨论

本研究筛选出槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能为黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的重要成分。经研究发现，槲皮素具有显著抑制小鼠手术引起的机械性痛觉异常[20]、减轻小鼠的氧化应激以提高骨性能[21]、抑制Wnt/β-catenin通路以减轻大鼠的神经病理性疼痛的功能[22]。β-谷甾醇具有与雌激素受体结合发挥雌激素或抗雌激素作用以调节骨代谢[23]、增加脑内去甲肾上腺素及其代谢产物减缓小鼠抑郁症状[24]的功能。山奈酚可通过炎症反应、氧化应激等多种途径发挥骨保护作用[25]。由这些药物成分的作用机制可知，黄芪桂枝五物汤可改善患者身心症状。

黄芪桂枝五物汤治疗疾病所涉及的主要基因靶点包括STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等。IRF1同干扰素调节因子家族的成员一样，其N端包含了5个色氨酸残基的DNA结合域，可形成的螺旋-转角-螺旋基序并识别干扰素刺激响应元件，C端的关联域可与其他同源或异质蛋白进行相互作用[26]。同时作为JAK-STAT信号传导中的关键转录因子，IRF1可以诱导STAT1磷酸化，进而激活STAT1[27]。STAT是一类重要的胞质转录因子，STAT1通过JAK和MAPK激活使自身C端激活区保守残基磷酸化，形成二聚体进入细胞核调节靶基因[28]。研究发现，成骨细胞中STAT1水平可影响RUNX2核转位从而起到调节成骨细胞的功能[29]。RELA是NF-κB家族重要的成员，除同源结构域外，还具有特殊的反式激活结构域，该结构域通过募集共转录调节因子和基础调节因子到靶基因调控下游基因转录。RELA翻译后修饰具有精准调控NF-κB转录活性的功能[30]，NFKBIA通过与NF-kB的关联分离和暴露保护来调节NF-κB的活性[31]，NF-κB是B细胞中提取的多功能核转录因子，可与染色体上κB序列特异性结合。NF-κB作为一种重要的转录因子，可参与到关节炎症和组织破坏[32]，同时NF-κB也作为重要的下游信号分子在抑郁症发病过程中发挥一定作用[33]。

富集分析显示，黄芪桂枝五物汤治疗疾病的主要通路包括破骨细胞分化、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路等。由破骨细胞介导的骨吸收和由成骨细胞介导的骨形成共同完成骨代谢过程[34]。其中，破骨细胞过度活化可能会导致骨骼代谢疾病[35]，预测此过程可能是黄芪桂枝五物汤治疗产后身痛的关键通路。研究发现，趋化因子受雌激素调控可在机体免疫调节中扮演重要角色[36]。其中，促炎因子白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α等可作用于下丘脑，引起HPA轴活化，参与产后抑郁发病的过程[37]。而产后抑郁又与产后身痛的产生、发展存在密切联系[38]，推测此过程可能是黄芪桂枝五物汤调理患者身心健康的重要组成部分。HIF-1是一种异源二聚体，其亚基HIF-1α，能调节多种基因的表达[39]。HIF-1α/Notch信号通路能够调节椎间盘中的细胞增殖、凋亡和代谢，并与椎间盘退变有关[40]。分子对接显示，关键化合物成分和筛选出的关键靶点的靶蛋白具有较好的亲和力，初步验证了一部分研究结果。

综上所述，黄芪桂枝五物汤中的槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能通过破骨细胞分化、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路等通路，作用于STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等靶点治疗产后身痛。但因网络药理学研究的条件限制[41]及相关疾病靶点收集不全面等因素影响，本研究结果存在一些不足，未来需继续对无法客观量化的中药成分进入人体后的代谢转换及其组织分布等进行深入研究[42]，细化研究方法，结合基础实验研究完善相关作用机制。