郭会，方艳君，李翠娥，段祥林

协和武汉红十字会医院骨科，武汉 430000

骨肉瘤（OS）是一种原发性恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，由未成熟骨和产生类骨质的间充质细胞组成，其复发率和转移率均比较高，手术切除联合放化疗是治疗OS 的主要方法，患者预后不佳，5 年生存率低于20%［1-2］。深入研究OS 的发病机制，对于了解OS 的发病及探索新疗法具有重要意义。微小RNA（miRNA）是短链小RNA 分子，不能编码蛋白质表达，可通过靶向mRNA 的3'非翻译区（3'-UTR）负调控基因表达［3］。miRNA 已被证明参与细胞增殖、迁移、炎症和细胞凋亡等多种生物学过程，可作为致癌基因或抑癌基因，在肿瘤发生过程中发挥重要调节作用［4］。研究显示，miR-20a-5p 在非小细胞肺癌组织中高表达，且可促进细胞增殖和转移［5］。但miR-20a-5p 在OS 细胞中的表达变化及其对细胞增殖、侵袭能力的影响鲜见报道，为此我们于2020年1月—2021年1月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：OS 细胞系（U-20S、143B、Saos-2）及正常人成骨细胞系hFOB1.19 均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。主要试剂：RPMI 1640 培养基购自美国Gibco 公司，10%胎牛血清、TRIzol 试剂、TaqMan Power SYBR Green PCR Mix 试剂盒、膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒、LipofectamineTM3000均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，蛋白印迹试剂盒、羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物技术有限公司，EntiLinkTMcDNA 合成试剂盒购自湖北ELK Biotechnology 公司，E2F 转录因子5（E2F5）、Bcl-2、GAPDH 一 抗 均 购 自 美 国Invitrogen 公 司，Bax 一 抗购自美国Santa Cruz 公司，miR-20a-5p PCR 引物序列、miR-20a-5p 过表达质粒（miR-20a-5p mimics）、miR-20a-5p 抑制质粒（miR-20a-5p inhibit）及阴性对照质粒（scramble）序列均由广州锐博生物公司设计合成。

1.2 细胞miR-20a-5p 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。将OS 细胞系（U-20S、143B、Saos-2）及正常人成骨细胞系hFOB1.19 置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。使用TRIzol 试剂提取总RNA，PrimeScript RT试剂盒、miR-20a-5p 引物和1µg 总RNA 合成第一链互补DNA（cDNA），使用EntiLinkTM第一链cDNA 合成试剂盒逆转录合成第一链cDNA。使用TaqMan Power SYBR Green PCR Mix 试剂盒在Applied Biosystems 7500 实时PCR 系统上行PCR 检测。PCR反应条件：95 ℃5 min ；95 ℃10 s 、59 ℃30 s 、72 ℃30 s ，共40 个循环。miR-20a-5p 引物序列：上游引物5'-GCCTCTCGCTCAACTGAATTG-3'、下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'，内参U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGGCAGCACAT-3'、下游引物5'-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt法计算miR-20a-5p相对表达量。

1.3 细胞培养及分组处理 将OS 细胞系143B 随机分为miR-20a-5p 过表达组、miR-20a-5p 抑制表达组及阴性对照组，通过LipofectamineTM3000 分别转染miR-20a-5p mimics、miR-20a-5p inhibit 及scramble，转染24 h。参照1.2 采用实时荧光定量PCR 法检测三组miR-20a-5p 相对表达量，结果显示miR-20a-5p 过表达组、阴性对照组及miR-20a-5p 抑制表达组miR-20a-5p 相对表达量分别为9.14 ± 0.26、3.12 ± 0.15、0.46 ± 0.08，组 间 两 两 比 较P均＜0.05；提示转染成功。

1.4 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。将三组细胞以5×103/孔接种到96孔板上，37 ℃条件下孵育过夜。每孔加入10µL CCK-8 试剂，再孵育2 h。三组细胞培养0、24、48、72 h，使用酶标仪检测每孔490 nm 处的光密度值（OD 值）。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取对数生长期的三组细胞，预冷的70%乙醇固定，加入5 µL 碘化丙啶（PI）和10 µL Annexin V-FITC，室温避光染色15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 细胞侵袭能力观察 采用Transwell 小室实验。将对数生长期的三组细胞接种在Transwell 侵袭小室上室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。孵育24 h 后，用棉签除去保留在上室的细胞，用甲醇和0.1%结晶紫固定穿膜细胞，200 倍光学显微镜下计数10 个视野内的穿膜细胞数，取平均值。

1.7 miR-20a-5p 靶向蛋白的确定 采用荧光素酶报告基因实验。在线数据库TargetScan（http：//www. targetscan. org/vert_71/）预测miR-20a-5p 的直接靶基因，结果显示E2F5存在与miR-20a-5p结合的潜在靶点，见图1。将含有野生型（WT）或突变型（MUT）miR-20a-5p 结合位点的E2F5 3'-UTR 片段克隆到荧光素酶基因中，建立WT-E2F5 和MUT-E2F5两个报告质粒。将荧光素酶报告基因实验通用的293 细胞系分为四分部分，分别将WT-E2F5、MUTE2F5 与miR-20a-5p mimics、对照载体使用LipofectamineTM3000进行共转染。共转染48 h，以海肾荧光素酶活性作为内源对照，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对活性。结果显示，共转染WT-E2F5 和miR-20a-5p mimics 的细胞荧光素酶相对活性为0.41±0.03，共转染WT-E2F5和对照载体的细胞为1.01 ± 0.03，二者比较P＜0.05；共转染MUT-E2F5 和miR-20a-5p mimics 的细胞荧光素酶相对活性为1.02 ± 0.02，共转染MUT-E2F5 和对照载体的细胞为1.01±0.04，二者比较P均＞0.05。

图1 miR-20a-5p直接靶基因的在线数据库TargetScan预测结果

1.8 细胞Bax、Bcl-2、E2F5 蛋白表达检测 采用Westen blotting 法。取对数生长期的三组细胞，使用10% SDS-PAGE 分离蛋白质（每条泳道50 µg）。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，室温下加入含5%脱脂牛奶的TBST，封闭1 h；加入Bax 一抗（1∶300）、Bcl-2一抗（1∶300）、E2F5一抗（1∶200）、内参GAPDH一抗（1∶300），4 ℃条件下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶500），室温下孵育2 h。添加ECL 液后曝光，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用GraphPad5.0 统计软件。计量资料采用偏度和峰度进行正态性检验，呈正态分布以-x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OS 及正常成骨细胞系中miR-20a-5p 表达比较 OS 细胞系U-20S、143B、Saos-2 中miR-20a-5p 相对表达量分别为1.94 ± 0.35、1.05 ± 0.13、0.35 ±0.06，均明显低于正常人成骨细胞系hFOB1.19 中的3.89±0.53（P均＜0.05）。

2.2 三组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 三组细胞培养不同时间的OD值比较（±s）

表1 三组细胞培养不同时间的OD值比较（±s）

注：与miR-20a-5p过表达组比较，*P＜0.05；与阴性对照组比较，#P＜0.05。

组别miR-20a-5p过表达组阴性对照组miR-20a-5p抑制表达组0 h 0.38±0.07 0.36±0.05 0.39±0.05 24 h 0.59±0.03 0.67±0.04*0.89±0.04*#48 h 0.77±0.04 0.90±0.03*1.43±0.03*#72 h 0.98±0.05 1.23±0.06*1.88±0.03*#

2.3 三组细胞凋亡能力比较 miR-20a-5p 过表达组、阴性对照组、miR-20a-5p抑制表达组细胞凋亡率分 别 为14.8% ± 2.3%、7.2% ± 0.9%、2.1% ±0.7%，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图1。

2.4 三组细胞侵袭能力比较 miR-20a-5p 过表达组、阴性对照组、miR-20a-5p抑制表达组侵袭细胞数分别为（50 ± 8）、（189 ± 11）、（387 ± 26）个，组间两两比较P均＜0.05。见OSID码图2。

2.5 三组细胞Bax、Bcl-2、E2F5 蛋白表达比较 见表2、OSID码图3。

表2 三组细胞Bax、Bcl-2、E2F5蛋白相对表达量比较（±s）

表2 三组细胞Bax、Bcl-2、E2F5蛋白相对表达量比较（±s）

注：与miR-20a-5p 过表达组比较，*P＜0.05；与阴性对照组比较，#P＜0.05。

组别miR-20a-5p过表达组阴性对照组miR-20a-5p抑制表达组Bax 2.10±0.15 0.95±0.08*0.26±0.05*#Bcl-2 0.24±0.05 0.90±0.10*2.01±0.10*#E2F5 0.30±0.05 0.97±0.06*1.96±0.09*#

3 讨论

OS是常见的原发性恶性骨肿癌，表现出异质性的组织学、遗传和分子特征，最常引起肺转移［6］。文献表明，一些miRNA在OS组织中表达失调，并在OS发生过程中充当致癌基因或肿瘤抑制因子［7］。miR-20a-5p是新鉴定的miRNA 分子，基因定位于12号染色体。miR-20a-5p 在肺动脉平滑肌细胞中表达上调，且miR-20a-5p上调可通过靶向ABCA1蛋白促进肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移，并抑制细胞凋亡［8］。依据所结合的靶基因功能不同，miR-20a-5p 在不同肿瘤中扮演着不同的角色。在肝细胞癌中miR-20a-5p 发挥抑癌基因作用，可通过阻滞HGF/ERBB3-NF-κB 信号通路抑制肝细胞癌术后转移，且miR-20a-5p 低表达与肝癌术后预后差有关［9］。在乳腺癌中miR-20a-5p 发挥抑癌基因功能，且上调miR-20a-5p 可通过靶向调节HMGA2 表达抑制细胞增殖、侵袭，并诱导细胞凋亡［10］。在子宫内膜癌中miR-20a-5p 表达下调，且上调miR-20a-5p 表达可靶向调节Jak1表达，从而抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和黏附能力，起抑癌基因作用［11］。在神经细胞瘤中miR-20a-5p 表达下调，且在SH-SY5Y 细胞系中miR-20a-5p 可通过负调控ATG7 表达而抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡［12］。在鼻咽癌中，miR-20a-5p 可通过靶向Rab27B 表达而增加放疗敏感性［13］。miR-20a-5p也可发挥促癌基因功能。在胃癌中miR-20a-5p 表达上调，并促进胃癌抑癌基因WTX 表达下调，且可通过磷酸化PI3K 激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路，促进胃癌进展［14］。在头颈部鳞癌中miR-20a-5p 表达上调，可下调TNFRSF21表达、上调CCR7表达，并促进细胞增殖、迁移和侵袭能力［15］。本研究结果显示，miR-20a-5p 在OS 细胞系中表达下调，且上调miR-20a-5p表达可抑制OS细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡；反之，下调miR-20a-5p 表达可显著促进OS 细胞增殖，并抑制细胞凋亡；这提示miR-20a-5p在OS的发生发展过程中发挥抑癌基因功能。

本研究通过生物信息学分析工具TargetScan 和荧光素酶报告基因实验证实miR-20a-5p 的潜在靶基因为E2F5。E2F 家族包括E2F1～E2F8 等8 个成员，其中E2F5 基因定位于8q21.2 区，在调控细胞周期G1相关蛋白（p130、p107 及pRb）表达中起至关重要的作用［16］。在肝细胞癌中，沉默E2F5表达可显著抑制细胞增殖，并引起细胞周期G1/S 期阻滞、抑制细胞侵袭［17］。E2F5 可被众多miRNA 调控，如miR-154-5p、miR-106、miR-98、miR-128-2、miR-34a 等［18］。在胶质瘤中，E2F5可直接与细胞周期相关基因结合并促进细胞周期进程，沉默E2F5表达可抑制胶质瘤细胞增殖［19］。E2F5 表达下调可抑制人类癌症中的细胞周期分布和细胞凋亡［20］。研究显示，miR-154-5p表达上调可通过下调E2F5，而诱导前列腺癌细胞在G1周期停滞［21］。本研究结果显示，上调miR-20a-5p 表达可显著降低OS 细胞中的E2F5 表达，因此miR-20a-5p 抑制OS 细胞增殖和侵袭的机制可能与其靶向下调E2F5表达有关。

细胞凋亡的两条途径包括内源性及外源性途径，外源性途径由肿瘤坏死因子受体1、Caspase-3、Caspase-8 等介导。线粒体途径即内源性途径，由凋亡信息刺激引起线粒体外膜通透性发生改变，并引起Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活化，终止DNA修复，并将DNA 裂解成小分子片段，细胞形态发生改变，最终导致细胞凋亡的发生。在引起线粒体外膜通透性改变过程中，Bcl-2 亚家族及Bax 亚家族扮演着重要角色，其中Bcl-2 起抗凋亡作用、Bax 起着促凋亡的作用。本研究结果显示，上调miR-20a-5p表达可促进OS 细胞凋亡，同时抑制凋亡因子Bcl-2表达下调，而促凋亡因子Bax 蛋白表达上调，这可能解释了上调miR-20a-5p 表达后可促进OS 细胞凋亡的原因。

综上所述，miR-20a-5p 在OS 细胞系中表达下调，而上调miR-20a-5p表达可抑制OS细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调E2F5、Bcl-2及上调Bax 蛋白表达有关。由于本研究是体外细胞研究，miR-20a-5p表达在裸鼠和OS患者预后中的作用仍有待研究。