陈婷婷，吐尔逊阿依·买买提，陈思宇，李爱梅

(新疆医科大学第一附属医院麻醉科,新疆 乌鲁木齐 830011)

目前，包括冠状动脉旁路移植术 (Coronary artery bypass grafting,CABG)、经皮腔内冠状动脉成形术 (Percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA) 和溶栓术在内的心脏治疗包括冠状动脉再通，可挽救缺血心肌并改善患者症状。但长期缺血后，患者在恢复血流灌注后可能会出现更明显、更严重的心肌组织损伤和功能障碍，包括收缩功能下降、冠状动脉血容量减少和血管反应性低下，称为心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注(Ischemia reperfusion,IR)发生在心脏，但可损伤心脏周围组织甚至远处器官，包括肺脏，这是对IR最脆弱的器官，并显示出最早的临床表现。因此，心肌IR诱导的急性肺损伤的分子机制已成为研究的热点[1]。糖尿病患者比非糖尿病患者冠状动脉疾病更严重，更容易发生急性心肌梗死。糖尿病患者出现多种呼吸功能异常，糖尿病心肌IR引起的急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)比非糖尿病患者更加严重[2]，然而其具体机制尚不清楚。内质网在细胞内发挥多种作用，包括钙储存、蛋白质合成和脂质代谢[3]。急性肺损伤对细胞的损害或蛋白质合成增加可导致蛋白质错误折叠。内质网中错误折叠或未折叠蛋白的积累引发内质网应激(Encloplsmic reticulum，ERS)。三个跨膜内质网应激传感器(PERK、IRE1α和 ATF6)与分子伴侣 GRP78 结合并保持非活动状态。在内质网中存在高水平错误折叠蛋白时，GRP78 与其腔结构域解离并诱导一系列转录和翻译事件，启动未折叠蛋白反应 (UPR)，从而恢复内质网稳态。然而，急性肺损伤引发持续高水平内质网应激，过度积累的错误折叠和未折叠蛋白以及钙紊乱最终导致细胞功能丧失、细胞炎症和死亡[4]。

白藜芦醇(Resveratrol,RSV)天然存在于葡萄、桑树和其他植物中，它是一种天然多酚，可以激活沉默信息调节因子1(Sirt1)，是迄今为止发现的最强的Sirt1激动剂[5-6]。它具有抗氧化作用，影响下游信号通路。以往大量的体内和体外研究表明，RSV可以通过激活Sirt1保护肺组织，发挥抗氧化应激、炎症、细胞凋亡及内质网应激的作用[7-8]。然而，RSV在糖尿病心肌缺血再灌注所致ALI中的作用尚未见报道。本研究就Sirt1激动剂白藜芦醇对糖尿病心肌IR所致ALI的保护作用及其与内质网应激的关系进行初步探讨。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:选用40只鼠龄6～8周的雄性SPF级Wistar大鼠,体重160～200 g，购自新疆医科大学实验动物中心。饲养环境的温度维持在18～22 ℃,湿度为60%～80%。

1.1.2 实验药物:白藜芦醇(杨凌慈缘生物技术有限公司,纯度为99%)；肝素钠注射液(常州千红生化制药股份有限公司,批号151805062A)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与模型制备:糖尿病大鼠模型的建立采用如下方案。所有大鼠均采用高脂高糖饲养，为期4周，禁饮食12 h，按照每千克体重65 mg的标准予0.1 mmol/L链脲佐菌素腹腔注射，72 h 后测大鼠尾静脉血血糖。糖尿病大鼠标准：血糖高于16.7 mmol/L，且持续1周，伴随多饮、多食、多尿症状，40只大鼠中共32只成功建模。

采用随机数字表法，将实验大鼠分为四组：假手术组(DS组)、缺血再灌注组(DIR组)、白藜芦醇低剂量组(RLIR组)、白藜芦醇高剂量组(RHIR组)，每组8只。大鼠于实验开始前12 h禁食，不禁饮。腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg,麻醉成功后取仰卧位固定，常规备皮，并予碘伏消毒3遍，连接心电图机电极片，记录标准Ⅱ导联，所有大鼠行气管插管并将其连接至小动物呼吸机，正压通气，通气容量1.2 ml/100 g,频率60次/min，I∶E=2∶1，从左侧开胸，左侧胸腔切开第四到五根肋骨，按500 IU/kg的标准从下腹部注射肝素钠至腹腔，眼科剪剪开心包后可见冠脉前降支，位于左心耳与肺动脉圆锥间，冠脉下穿线备用。假手术组不做额外处理，双线结扎其余组的冠脉前降支，若心电图示T波高耸，ST段上抬，结扎处远端颜色变暗和收缩力减弱则说明心肌缺血，30 min后松开结扎线，恢复血流2 h。

1.2.2 给药方法：RLIR组及RHIR组于模型制备前15 min及再灌注前1 min尾静脉分别注射白藜芦醇10 mg/kg及20 mg/kg。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肺损伤的组织学检查：各时间点实验结束后采集每组大鼠的右侧肺，取右肺上叶部分在4%多聚甲醛固定嵌入，并制成5 μm切片。这些切片用苏木精和伊红染色，光镜下观察肺组织损伤程度。

1.2.3.2 动脉血指标检测：实验结束后取颈动脉血测量氧分压，并分离血清，采用CBA法测量血清IL-4、IL-6、TNF-α水平。

1.2.3.3 肺湿干重比(W/D)：实验结束后剥离左肺并取出，记录湿重，干燥脱水后再次称重，计算各肺叶湿干重比。

1.2.3.4 采用Western blot法检测肺组织Sirt1水平及内质网应激蛋白水平：取肺组织剪成小块，研磨后匀浆离心，取上清液，以BCA 法测定蛋白浓度，另取50 μg 进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后加入GRP78(1∶500)、CHOP(1∶200)、Sirt1(1∶500)或β-actin抗体(1∶800)与一抗孵育过夜，以PDS洗膜3遍后加入HRP 标记的二抗，再次以PDS洗膜，共3遍，进行显影，分析灰度值并计算各目标蛋白与β-actin的比值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析，连续性变量数据比较使用单因素方差分析；计量资料符合正态分布且方差齐，组间比较使用t检验，不符合正态分布采用秩和检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肺组织病理改变情况比较 DS 组肺泡结构清晰，上皮结构完整，间质和肺泡腔内未见明显液体渗出和炎症细胞浸润;DIR组肺组织严重受损，肺泡结构紊乱，肺泡内有大量的液体渗出，有较多的炎症细胞浸润，肺泡内可见较多的红细胞,呈现弥漫性肺间质水肿。与DIR组相比，RHIR组肺泡结构相对完整，间质轻度水肿，肺泡内的液体、炎症细胞、红细胞明显减少。RLIR组镜下病理学改善不明显(图1)。

A:DS组；B:DIR组；C:RLIR组；D:RHIR组图1 各组肺组织病理切片(HE染色，×200)

2.2 肺组织W/D比较 与DS组比较，DIR组大鼠肺W/D比值增大，差异有统计学意义(P<0.05)。与DIR组比较，RHIR组W/D比值降低，差异有统计学意义(P<0.05)。RLIR组与DIR组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 各组动脉血氧分压比较 与DS组比较，DIR组大鼠动脉血氧分压降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与DIR组比较，RHIR组血氧分压升高，差异有统计学意义(P<0.05)。RLIR组与DIR组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组肺组织W/D、动脉血氧分压比较

2.4 各组血清IL-4、IL-6、TNF-α水平比较 与DS组比较，DIR组大鼠血清IL-6、TNF-α升高，IL-4降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与DIR组比较，RHIR组IL-6、TNF-α降低，IL-4升高，差异有统计学意义(P<0.05)。RLIR组与DIR组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组IL-4、IL-6、TNF-α水平比较(pg/ml)

2.5 Western blot法检测各组肺组织Sirt1、GRP78、CHOP的表达水平 与DS组比较，DIR组肺组织Sirt1蛋白水平降低，CHOP、GRP78蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与DIR组比较，RHIR组Sirt1蛋白水平升高，CHOP、GRP78蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。RLIR组与DIR组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

3 讨 论

心肌缺血再灌注可引起机体诸多损伤及应激反应，其中之一便是肺损伤，而糖尿病患者的肺CO2弥散能力降低，支气管运动张力异常，对缺氧的通气反应减弱，呼吸肌肉强度降低，糖尿病可显著加速呼吸功能的恶化[9]。因此糖尿病心肌缺血再灌注所致急性肺损伤更加严重[10]。本研究显示，糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后导致了的肺组织损伤和肺水肿，动脉血氧分压下降，循环中炎症因子增加，Sirt1表达水平下降并伴有GRP78、CHOP表达的增加。

内质网(ER)是真核细胞中常见的细胞器，是合成和修饰蛋白质、脂类和碳水化合物的重要部位。在生理条件下,三种类型的跨膜蛋白PERK、IRE1、ATF6在内质网的膜侧与细胞内GRP78/Bip结合形成稳定复合物。当未折叠蛋白或错折叠蛋白在内质网中聚集时，GRP78/Bip接收信号并与跨膜蛋白解离，同时与未折叠蛋白结合激活PERK、IRE1和ATF6这三条经典的信号转导通路[11]。信号转导通路促进蛋白质的正确折叠，抑制蛋白质的产生，加速非功能蛋白的降解，增强内质网的自我修复能力。Bip属于热休克蛋白70 (HSP70)家族，是ER的分子伴侣，又称GRP78。它在ERS的调节中起着重要的作用，其激活可以作为ERS反应的标记物。各种自身因素和外部环境，如细胞缺氧、细胞氧化应激、营养不良、化学药物刺激、钙稳态丧失等，可触发内质网异常蛋白积累，从而诱发ERS。然而随着ERS的持续，内质网的稳态无法维持，可引起细胞凋亡。凋亡过程可通过诱导CHOP，活化Caspase-12，激活JNK信号通路而启动。因此，GRP78和CHOP通常作为反映ERS水平的生物标志物[12]。近年研究表明，ERS在缺血再灌注损伤中发挥重要的作用，缺血再灌注可导致内质网功能的内稳态失衡引发ERS。越来越多的研究表明ERS参与各种因素所导致的肺损伤，并且在急性肺损伤的发生发展过程中发挥重要的病理生理作用[13-14]。研究证实ERS在2型糖尿病的病理生理机制中发挥了重要的作用，肥胖和2型糖尿病诱导的低度慢性炎症和低氧微环境可导致内质网腔内异常折叠蛋白的积累[15]。本研究结果表明糖尿病心肌IR可引起肺组织ERS蛋白GRP78及CHOP的表达增加，说明内质网应激参与了心肌缺血再灌注所致肺损伤的发病机制。

Sirt1是一种 NAD+ 依赖性蛋白质脱乙酰酶，对多种细胞过程至关重要，包括代谢、炎症、应激反应和干细胞功能。Sirt1也是动物发育的关键调节因子，在中枢神经系统中尤为重要。如Sirt1对下丘脑功能有重大影响，细胞类型特异性 Sirt1突变导致全身能量代谢、昼夜节律和动物寿命的缺陷,SIRT1还调节树突和轴突生长，并调节成人大脑中的突触可塑性和记忆形成。此外，Sirt1已被证明可以改善阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病[16]。Sirt1可能是调控ALI的潜在靶点，在不同类型的急性肺损伤中均发挥着重要作用[17]。研究表明RSV可通过激活Sirt1减轻肺水肿，下调致炎细胞因子的产生来保护肺组织[18-19]。此外，Sirt1在调节内质网应激方面也发挥了重要的作用，它可通过调控内质网相关分子ORP150减轻或者缓解内质网应激[20]。研究证实Sirt1可通过PERK/eIF2α、ATF6/CHOP和 IRE1α/JNK介导的通路抑制内质应激诱导的心肌细胞凋亡[21]。本研究结果表明Sirt1在糖尿病心肌IR后肺组织表达降低，而高剂量RSV可显著激活Sirt1水平，明显改善肺组织病理学损伤和肺水肿，提高动脉血氧分压，并且伴有GRP78、CHOP的减少，说明Sirt1可通过调控ERS减轻肺损伤。

综上所述，白藜芦醇对糖尿病心肌IR所致肺损伤具有保护作用，其作用机制与激活Sirt1，抑制内质网应激相关，但是否有其他途径，尚需进一步研究。