钟云青，王秀峰，但晓霞，杨树栋，王 丽

(1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

支气管扩张症由各种原因引起的支气管树的病理性、永久性扩张，导致反复发生化脓性感染的一种常见的气道炎症性疾病，可严重损害患者肺组织和肺功能，影响患者的生活质量[1]。临床表现为慢性咳嗽、大量咳痰、间断咯血，伴或不伴气促和呼吸衰竭。支气管扩张症在亚洲人群中属于常见病，我国支气管扩张症的患病率可能远高于欧美国家。一项国内研究对7省市城区40岁以上居民进行电话调研，结果提示有1.2%的居民曾被诊断为支气管扩张症，该病的患病率随着年龄增加而提高[2]。感染是支气管扩张症最常见原因，是促使病情进展和影响预后的最主要因素。感染引起支气管管腔内中性粒细胞募集及支气管壁和肺组织内中性粒细胞、淋巴细胞浸润，并激活、释放白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)及白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)等多种炎症因子，形成气道炎症，气道炎症是支气管扩张症的重要病理生理特征[3]。持续的气道炎症导致气道结构破坏和气道重塑，进一步影响气道分泌物排出，如此循环往复，导致支气管永久性病理性扩张。

按支气管扩张症发展的不同程度和阶段，将其归入中医“咳嗽”“肺痈”“咯血”等范畴，现今命名为“肺络张”。该病的病机复杂，文献显示，痰热蕴肺证为支气管扩张症最常见中医证型[4-6]。本实验通过建立支气管扩张症大鼠模型，选择清热化痰方款冬花散作为干预措施，研究款冬花散对支气管扩张症痰热蕴肺证模型大鼠气道炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠70只，体重200～230 g，购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2 实验药物：款冬花散(款冬花 15 g，炙麻黄、浙贝、桑白皮、紫菀、旋覆花、白术各10 g，生石膏 30 g，前胡 12 g，甘草 6 g)。购自北京同仁堂医药药材有限公司，煎剂由中药制剂室制作，先将中药用500 ml清水浸泡1 h，再经煎药机煎1 h，煎成200 ml/剂，再经-70 ℃制成冻干粉，封存于-20 ℃冰箱中备用。在实验前用0.9%氯化钠水溶液按1 g生药/ml配制备用。罗红霉素胶囊(江苏扬子江药业集团有限公司生产，国药准字H10970291)。

1.1.3 实验试剂与仪器：绿脓杆菌(由南宁天地杨生物科技有限公司培养)，苏木素(批号：H9627，Sigma公司)，伊红Y(水溶性)(批号：71014544，国药集团)。大鼠LTB4 ELISA检测试剂盒(批号：CK-E30427R)，大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒(批号：CK-E30635R)，大鼠IL-10 ELISA检测试剂盒(批号：CK-E30651R)，大鼠IL-8 ELISA检测试剂盒(批号：CK-E30583R)均由苏州卡尔文生物技术有限公司提供。TRIzol(批号：182805，上海索宝生物科技有限公司)，纯化试剂盒(批号：DP204-02，天根生物科技公司)，反转录试剂盒(批号：K1632，Thermo Fisher scientific公司)，荧光定量试剂盒(批号：RR820A，TaKaRa公司)。

RM2066转轮式切片机(德国Leica公司)，凝胶成像分析系统(美国Bio-RAD公司)，GeneAmp 9700PCR扩增仪(美国ABI公司)，StepOnePlus实时荧光定量 PCR仪(美国ABI公司)，5810R高速低温离心机(德国Eppenndorf公司)，超微量分光光度仪(美国Thermo公司)，DMI8倒置显微镜(德国徕卡公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模、分组及给药：将70只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白组、款冬花散自身对照组、模型组、罗红霉素组、款冬花散低、中、高剂量组，每组各10只。各组大鼠适应性喂养5 d，空白对照组和款冬花散自身对照组正常饲养，其余五组参照万毅刚等[7]造模方法建立支气管扩张症大鼠模型：以4 %戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，选择唇下3 cm处，常规消毒，做纵向1 cm切口，暴露颈部肌群，纵向分离出气管。选择环状软骨下较宽的气管软骨间隙做2 mm的横向切口，将自制气管插管微向右缓慢伸至胸骨角下约3 cm处，出现抵触感，即右肺中下叶。以微量进样器从插管中快速注入0.02 ml 105CFU/L绿脓杆菌液和1 ml气体。迅速拔出插管并保持大鼠垂直体位，待大鼠呼吸平稳后缝合气管切口、颈部肌群及皮肤。每只大鼠每天予青霉素G 1万U腹腔注射，连续3 d，以防伤口感染。

由于造模过程中存在大鼠死亡，造模后各组大鼠的数量分别为：空白组(8只)、款冬花散自身对照组(8只)、模型组(10只)、罗红霉素组(8只)、款冬花散低剂量组(9只)、款冬花散中剂量组(8只)和款冬花散高剂量组(10只)。自造模第3周后第1天起开始灌胃干预，罗红霉素组给予罗红霉素5 mg/(kg·d)灌胃，参照人与大鼠临床等效剂量换算方法[8]款冬花散低、中、高剂量组分别给予款冬花散5.57、11.14、22.28 ml/(kg·d)，款冬花散自身对照组给予款冬花散22.28 ml/(kg·d)灌胃，空白组及模型组分别给予22.28 ml/(kg·d) 0.9%氯化钠水溶液灌胃，连续给药2周。

1.2.2 标本采集：末次给药后各组大鼠禁食12 h，以4 %戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用止血钳夹闭右下肺近肺门处，取下各组大鼠右下肺，PBS漂洗后，一部分固定于4 %多聚甲醛缓冲液用于病理学形态观察，一部分放入液氮中保存以备提取RNA测定。以止血钳夹闭左侧肺门，插入钝钢针头行右肺支气管肺泡灌洗，用5 ml注射器注入2 ml无菌0.9%氯化钠水溶液，保留2 min后缓慢回抽，回收肺泡灌洗液(BALF)原液，反复灌入3次，收集于10 ml灭菌离心管中。将BALF原液4 ℃、4000 r/min、离心半径9.5 cm，离心5 min后，取其上清液分装于EP管中，-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 大鼠肺组织形态学观察：取经4%多聚甲醛固定后的大鼠肺组织，进行常规石蜡包埋、切片，然后进行二甲苯脱蜡、无水乙醇脱水、苏木素-伊红染色、中性树胶封片，镜下观察各组大鼠支气管与肺组织形态学改变。

1.2.4 各组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量检测：取各组分装的BALF，采用ELISA法检测各组大鼠LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 肺组织LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表达水平检测：提取50 mg肺组织，剪碎并加入1 ml Trizol，用漩涡混匀仪器震荡混匀，4 ℃、12000 r/min、离心半径9.5 cm，离心10 min，取上清加入异丙醇(上清液与异丙醇比例为1∶1)震荡后插入冰中20～30 min，4 ℃、12000 r/min、离心半径9.5 cm，离心10 min，弃上清加入1 ml 75%乙醇，4 ℃、12000 r/min、离心半径9.5 cm，离心10 min，弃上清挥发干净酒精，加入15～20 μl PCR专用水，震荡混匀后后采用超微量分光光度仪对RNA 样本纯度测定，根据试剂盒要求将RNA反转录为cDNA，-80 ℃保存，待做荧光定量PCR。引物由南宁天地杨生物科技有限公司设计，LTB4上游：5’-TCCCTTTTTCCTACATC-3’，下游：5’-GCTGGCATCCATGCTTC-3’；TNF-α上游：5’-CCTCACCCACACCGT-3’，下游：5’-GCAGGTCCCCCTTAT-3’；IL-8上游：5’-GGAGAAATCAGGGTGGAT-3’，下游：5’-CGACAGAGTAAAGGGCGG-3’；IL-10上游：5’-GACCCACATGCTCCGAGA-3’，下游：5’-TGGCAACCCAAGTAACCC-3’；β-actin上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。提取循环结束后的ΔCt值，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学形态观察 正常组和自身对照组大鼠肺组织有少许炎性细胞浸润，支气管壁未见明显扩张增厚，支气管周围肺组织未见萎缩和纤维化。模型组大鼠肺组织可见支气管壁扩张增厚，支气管周围肺组织可见大量炎性细胞浸润，邻近肺组织出现纤维化，黏膜下血管扩张充血。罗红霉素组、款冬花散高、中、低剂量组大鼠肺组织病理表现明显改善，黏膜下血管扩张充血减轻，炎性细胞浸润减少，支气管扩张周围肺组织肺纤维化有所改善(图1)。

A：空白组；B：款冬花散自身对照组；C：模型组；D：罗红霉素组；E：款冬花散低剂量组；F：款冬花散中剂量组；G：款冬花散高剂量组图1 款冬花散对支气管扩张大鼠肺组织病理形态学变化的影响(HE染色，×20)

2.2 款冬花散对各组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10的含量均明显升高差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，款冬花散低、中、高剂量组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与款冬花散低剂量组比较，中剂量干预组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10的含量均较低，差异有统计学意义(P<0.01)；与款冬花散中剂量组比较，高剂量干预组大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量的水平较低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠BALF液LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量比较(pg/ml)

2.3 款冬花散对各组大鼠肺组织LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10 mRNA 表达水平影响 与空白组比较，模型组大鼠肺组织LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表达均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，款冬花散中、高剂量组大鼠肺组织LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表达均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与款冬花散低剂量组比较，中、高剂量干预组大鼠肺组织LTB4 mRNA表达均较低，差异有统计学意义(P<0.01)，高剂量干预组TNF-α mRNA、IL-8、IL-10表达均较低，差异有统计学意义(P<0.01)；与款冬花散中剂量组比较，高剂量干预组大鼠肺组织LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表达均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 款冬花散对各组大鼠肺组织LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10 mRNA 表达水平影响

3 讨 论

支气管扩张症的患病率随年龄增长而增高，年住院率逐年增加，造成沉重的社会经济负担，成为全球性公共卫生问题。无论在支气管扩张症急性加重期或稳定期，支气管管腔内、管壁和肺组织内均存在着炎症细胞浸润，持续性气道炎症是支气管扩张症重要特征之一[9-11]。

中医认为，肺为娇脏，喜润恶燥，易聚湿成饮，饮凝成痰，伏于肺金之痰极易化热或外邪犯肺，郁而化热，热伤肺津，炼液成痰，以致痰热互结，蕴结于肺，阻碍气机，甚则熏灼肺络、迫血妄行而引致咯血[12]。《明医指掌·痰证》中说：“未有有痰而无火，未有有火而无痰者也。……痰胜，则泛滥洋溢，以生诸病。……火者，助痰为虐之贼也。”临床上支气管扩张症在急性加重期时，往往表现出“热”和“痰”的中医症状和舌脉象，症见咳嗽，痰多黏稠，咯吐不爽，口干口渴，身热，舌红，苔黄腻，脉滑数。痰热蕴肺证为支气管扩张症最常见中医证型，治疗应以清热化痰为法。

款冬花散源于《妇人大全良方》卷之十三妊娠咳嗽方论第七，组成为款冬花、炙麻黄、浙贝、桑白皮、生石膏、前胡、紫菀、旋覆花、白术、甘草。款冬花归肺经，能润肺下气，止咳化痰；炙麻黄味辛，善于宣肺平喘；浙贝药性苦寒，长于清热化痰；桑白皮泻肺平喘，主治肺热喘咳；生石膏清热泻火，清泄肺热作用较强；前胡善于降气祛痰；紫菀化痰止咳；旋覆花消痰降气；脾为生痰之源，肺为贮痰之器，白术健脾燥湿；甘草性平味甘，能止咳化痰、调和药性。诸药配伍，全方共奏清热化痰，平喘止咳之功[13]。

药理研究表明款冬花含有萜类、黄酮、生物碱等化学成分，具有抗炎、止咳、祛痰、平喘等药理活性[14-15]；麻黄碱对支气管平滑肌有松弛和解痉作用[16]；浙贝有镇咳、祛痰、松弛平滑肌作用[17]；桑白皮有抗炎、镇咳、平喘作用[18-19]；生石膏通过降低下丘脑前列腺素E2含量而起抗炎作用[20]；前胡的挥发油成分对大肠杆菌、伤寒沙门菌等有一定的抗菌活性[21-22]；紫菀药理作用广泛，有抗菌、镇咳、祛痰、平喘等作用[23]；旋覆花对铜绿假单胞菌、金葡菌、大肠杆菌等有抗菌活性[24]。

款冬花散原方用于妊娠心膈痰毒壅滞，肺气不顺之咳嗽[13]。但我科结合此方组成及功效，临床上用于慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张症等肺病表现为痰热郁肺证者相当安全、有效。本课题组前期研究发现款冬花散能有效改善慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰热郁肺证患者的肺部证候，提高临床疗效，改善血气分析及肺功能指标[25]。本课题组另一项研究亦发现，在常规西医治疗基础上加用款冬花散能更明显的改善支气管扩张症痰热壅肺证患者的临床症状，降低血液中白细胞计数、中性粒细胞数、快速C反应蛋白、血沉及降钙素原等炎症指标，具有较好的临床疗效[26]。在本实验中，我们以肺组织病理改变，TNF-α、LTB4、IL-8及IL-10含量及mRNA表达水平作为气道炎症程度的评价指标，结果表明，款冬花散能减轻支气管扩症痰热蕴肺证模型大鼠的肺组织炎症程度，能降低BALF及肺组织的LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10含量及mRNA表达水平，且以高剂量组较为明显，具有一定的量效关系趋势。

因此，款冬花散能在一定程度上减轻支气管扩张症痰热蕴肺证模型大鼠气道炎症状态，并呈现一定的量效关系趋势，有望成为支气管扩张症新的治疗药物，让更多的患者受益。