陈 琼，金毓莉，杭远远，徐 梅，唐苾芯

(1.上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；3.上海市黄浦区中西医结合医院，上海 200010；4.上海市浦东新区公利医院，上海 200135)

卵巢储备功能是指卵泡在卵巢皮质中生长并形成可受精卵泡的能力，包括女性剩余卵母细胞的数量和质量[1]。育龄期女性随着年龄的增长，卵巢中募集的卵泡逐渐减少，卵子的质量也在下降，这一过程称为卵巢储备功能降低(Decreased ovarian reserve，DOR)，预示着生育能力下降，在1～6年内有发展成为卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的风险[2]。2004—2011年，美国DOR患病率从19%升高至26%[3]。DOR的主要症状包括40岁以前女性出现月经紊乱、闭经和不孕，并伴有围绝经期症状，如潮热、盗汗，与反复流产、不明原因的不孕、辅助生殖反复种植失败、先兆流产等生育问题密切相关。因此，有效治疗DOR对不孕夫妇和提高女性生活质量具有重要意义。

中医药基于“治未病”的思想上治疗DOR具有独特优势。蔡氏妇科育肾助孕方的临床疗效显著，前期研究证实，育肾助孕方可上调卵巢抗凋亡因子Bcl-2的表达，下调促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达，从而抑制卵巢颗粒细胞凋亡[4]，促进卵泡生长、分泌，起到改善卵巢储备功能的作用[5]。细胞凋亡指为维持细胞内环境平衡的一种程序性死亡。MAPK信号通路(包含ERK通路和JNK通路)与细胞分化、增殖和凋亡密切相关。有研究证实ERK和JNK信号通路在卵巢细胞凋亡中起关键作用，是Bcl-2、Bax、Caspase-3的上游激酶[6]。故本研究结合前期研究结果，以DOR大鼠模型为研究对象，观察育肾助孕方对卵巢组织中ERK1/2及JNK1/2蛋白活化的影响，探讨其作用机制，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康清洁级雌性SD大鼠，12周龄，48只，体重250～280 g，上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，许可证号：SYXK(沪)2009-0086，检疫合格备用。大鼠饲养在上海市第一人民医院清洁级实验动物中心，室内保持恒定温度、湿度，相对湿度为40%～60%。

1.2 实验药物及制备 雷公藤多苷片：10 mg/片，江苏美通制药有限公司(批号：131029)，以纯净水溶化，配制浓度为5 mg/ml。戊酸雌二醇片(补佳乐)：1 mg/片，用纯净水溶化，配制浓度为0.05 mg/ml。育肾助孕方免煎颗粒剂(由广州一方中药厂提供)：白茯苓12 g，熟地、山萸肉、淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉、鹿角霜、醋龟板各10 g，上述药物等量免煎颗粒剂剂量为：熟地2.5 g，白茯苓0.6 g，山萸肉、巴戟天各3 g，淫羊藿、鹿角霜各0.5 g，肉苁蓉2.5 g，醋龟板0.7 g，纯净水配制成低、中、高3个浓度混悬液，4 ℃冰箱中储存备用，灌胃前摇匀。

1.3 主要试剂与仪器 p-ERK抗体，美国CST公司(批号：4370S)；ERK抗体，美国CST公司(批号：4376S)；p-JNK抗体，美国CST公司(批号：4668)；JNK抗体，美国CST公司(批号：9252)；GAPDH抗体，美国CST公司(批号：5174)；羊抗兔HRP标记二抗，上海碧云天生物技术有限公司(批号：A0208)；羊抗鼠HRP标记二抗，上海碧云天生物技术有限公司(批号：A0216)；RIPA组织细胞快速裂解液，上海基尔顿生物有限公司(批号：BYL40825)；BCA蛋白定量试剂盒，美国Thermo Scientific公司(批号：PICPI23223)；NC膜，美国millipore公司(批号：HATF00010)；蛋白预染Marker，加拿大Fermentas公司(批号：SM1811)；发光液，美国Millipore公司(批号：WBKLS0100)；mini protean 3 cell电泳仪(美国Bio-Rad公司)；PS-9型电转仪(大连竞迈科技有限公司)；MK3型酶标仪(芬兰雷勃公司)；CX41型正置显微镜(OLYMPUS公司)。

1.4 分组及给药 将48只SD大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为六组：对照组，模型组，补佳乐组，育肾助孕方低、中、高剂量组，每组8只。每组连续2周上午及下午各灌胃1次。对照组：每日2次灌胃3 ml 0.9%氯化钠水溶液；模型组：雷公藤多苷造模剂量按照50.00 mg/kg体积灌胃，雷公藤多苷溶液及0.9%氯化钠水溶液各1次；补佳乐组：补佳乐按照0.21 mg/kg体积灌胃，雷公藤多苷溶液及补佳乐溶液各1次；育肾助孕方低、中、高剂量组按照临床等效剂量的0.5倍(0.69 g/kg)、1倍(1.38 g/kg)和2倍(2.76 g/kg)给药，每次灌胃前摇匀，每组雷公藤多苷溶液及各浓度育肾助孕方中药溶液各1次。以上给药剂量均根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算出药液体积稀释为3 ml。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 取材：大鼠处死后在无菌条件下取出卵巢，称重，部分卵巢福尔马林固定，部分卵巢置于-80 ℃冰箱待用。

1.5.2 卵巢组织形态观察：卵巢置于福尔马林中固定48 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋切片，片厚4 μm，常规HE染色，置于显微镜下观察卵泡、黄体及颗粒细胞等变化。

1.5.3 Western blot法检测卵巢组织ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2及p-JNK1/2蛋白表达：将卵巢组织剪成细小的碎片，按每20 mg组织加入150～250 μl裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，匀浆器匀浆直至完全裂解，离心15 min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。用BCA试剂盒检测蛋白含量。按实验常规上样、电泳、转膜后，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后加入一抗(ERK1/2 1∶1000稀释，p-ERK1/2 1∶1000稀释，p-JNK1/2 1∶800稀释，JNK1/2 1∶1000稀释，GAPDH 1∶1500稀释)，4 ℃过夜孵育；之后加入二抗，与膜37 ℃孵育1 h。ECL化学发光法显影。胶片扫描后获得图像，计算目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的灰度比值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，所有统计图采用Graph Pad Prism软件绘制。组间比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢组织病理观察结果 对照组卵巢结构清晰，可见生长卵泡数量、形态正常，颗粒细胞多层排列整齐，卵泡液含量多，可见发育好、体积大的黄体；模型组见部分卵巢萎缩，生长卵泡数量减少、闭锁卵泡数量增多，颗粒细胞排卵紊乱且层数减少，黄体数减少、体积减小；补佳乐组卵巢组织形态与对照组相近，可见生长卵泡，但闭锁卵泡较对照组多；育肾助孕方低剂量组较模型组卵巢组织形态有所改善，卵泡数量比对照组少，黄体数目也比对照组少；育肾助孕方中、高剂量组卵巢形态与对照组相似，卵泡结构清晰，颗粒细胞多层次，卵泡数目及黄体数目较模型组增多(图1)。

图1 各组大鼠卵巢组织形态比较(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白总相对表达量及磷酸化水平比较 与对照组比较，模型组、补佳乐组和育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白总相对表达量比较均无统计学差异(P>0.05)；与对照组比较，模型组和育肾助孕方低、中剂量组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白磷酸化水平明显增加(P<0.05)，补佳乐组和育肾助孕方高剂量组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白磷酸化水平比较均无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，补佳乐组和育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05)；与补佳乐组比较，育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白磷酸化水平比较无统计学差异(P>0.05)。见表1(图2、3)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05图2 各组大鼠卵巢组织ERK1/2蛋白总相对表达量及磷酸化水平比较

2.3 各组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白总相对表达量及磷酸化水平比较 与对照组比较，模型组、补佳乐组和育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠卵巢组织JNK蛋白总相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与对照组比较，模型组和育肾助孕方低剂量组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白磷酸化水平明显增加(P<0.05)，补佳乐组和育肾助孕方中、高剂量组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白磷酸化水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，补佳乐组和育肾助孕方低、中、高剂量组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05)；与补佳乐组比较，育肾助孕方中、高剂量组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白磷酸化水平差异均无统计学意义(P>0.05)，低剂量育肾助孕方组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白磷酸化水平明显高于补佳乐组(P<0.05)。见表1(图3、4)。

表1 各组大鼠卵巢组织ERK1/2和JNK1/2蛋白总相对表达量及磷酸化水平比较

A:对照组；B：模型组；C:补佳乐组；D:育肾助孕方低剂量组；E:育肾助孕方中剂量组；F:育肾助孕方高剂量组图3 各组大鼠卵巢组织p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2蛋白表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与补佳乐组比较，△P<0.05图4 各组大鼠卵巢组织JNK1/2蛋白总相对表达量及磷酸化水平比较

3 讨 论

DOR是常见的女性生殖内分泌疾病。现代研究发现DOR发病常与年龄增长、遗传因素、自身免疫因素、盆腔因素、环境污染、不良生活方式、精神压力等有关[7]。

中医学中无DOR，根据其临床症状可归于“闭经”“月经后期”“断经前后诸证”“不孕”等疾病中。生育能力是指在1个月经周期内受孕的概率，其在30岁初即开始显著下降，几年后(约37岁)下降得更快[8]。随着国家二胎政策进一步开放和初产妇平均年龄逐渐升高，年龄越大，生育力越低，越来越多的高龄女性不得不面对不孕症。据统计，35岁以下的不孕患者中DOR发病率约6.3%[9]。DOR是POF的早期阶段，临床表现无特异性，需要结合检查如：抗苗勒管激素(AMH)下降、促卵泡刺激素(FSH)升高、雌二醇(E2)下降、FSH/LH升高、超声下见卵巢体积缩小等。因此，若40岁之前的女性出现了经量减少、月经稀发、崩漏甚至闭经、围绝经期表现时，应及时明确诊断，做到未病先防，已病防变，早发现早干预DOR。

雷公藤属于细胞毒性药物，具有生殖毒性。本研究中，模型组见部分卵巢萎缩，生长卵泡数目减少，颗粒细胞减少和黄体减少，各级卵泡数目减少，提示雷公藤多苷灌胃可致大鼠的卵巢功能降低，进而卵巢萎缩，该结果与杜清等[10]的结果一致。说明雷公藤多苷能够明显降低大鼠的卵巢储备功能、减少卵泡数量。有研究发现，氟化钠可通过促进p-ERK及p-JNK活化，降低Bcl-2表达，增加Bax表达，触发Caspase级联反应诱导卵巢细胞凋亡[6]。雷公藤多甙片[11]可能通过ERK、JNK信号通路诱导卵巢组织中线粒体和死亡受体凋亡途径发生过度激活，造成细胞凋亡，抑制卵泡生长，引发卵巢功能损伤。雷公藤甲素可通过引起ERK/c-fos异常表达导致卵巢细胞凋亡[12]。JNK促进促凋亡蛋白Bax在激活时移位到线粒体，从而激活细胞凋亡[13]。本研究结果显示模型组大鼠的p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表达较对照组明显升高，结合前期研究结果[4]提示雷公藤多苷可能通过促进p-ERK1/2及p-JNK1/2活化，调节细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，从而诱导DOR的发生。

蔡小荪教授治疗不孕基于《傅青主女科》云：“经水出诸肾”“经水早断，似乎肾水衰涸”以补肾为基本法则创制育肾助孕方，临床亦以补益肝肾，培元育孕为治疗DOR的主要思路，育肾助孕方从六味地黄丸化裁，仅用其半，熟地、茯苓、山萸肉补脾肾和中，养血滋阴；淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉温肾兴阳；鹿角霜补肾强督，调理冲任，性较温和；醋龟板滋阴潜阳，补肾益精，制约诸温阳药之温燥，以使阴阳平衡而相得益彰。《医学正传》曰：“月经全借肾水施化，肾水既乏，则经血日以干涸”，故临床医家多认为DOR的主要病机在肾虚，补肾填精为治疗大法[14-16]。育肾助孕方中用以大量补肾药，在补肾的同时注意顾护脾气，后天源源不断生化精微，涵育先天，重振根基，从而为孕育夯实基础。近年来多项研究表明：补肾中药能抑制卵巢颗粒细胞凋亡[17]；干预氧化应激过程，延缓端粒衰老速度，保护卵母细胞，延缓卵巢组织衰老[18]；补肾中药能作用于性激素、内分泌、免疫、细胞增殖等多个通路，其中补肾阳中药在卵细胞成熟相关通路存在作用靶点[19-20]，达到从多途径、多阶段、多靶点改善DOR患者的临床症状、内分泌指标以及妊娠结局的治疗目的。该研究结果显示，补佳乐和育肾助孕方各组卵巢组织形态、卵泡生长和颗粒细胞排列等较模型组改善，提示药物治疗后可能对卵巢功能有所改善，中药浓度升高可能与改善程度正相关。补佳乐组、育肾助孕方高剂量组p-ERK1/2及p-JNK1/2表达均与对照组比较无统计学差异。育肾助孕方各组p-ERK1/2及育肾助孕方中、高剂量组p-JNK1/2蛋白表达与补佳乐组比较无统计学差异，且均明显低于模型组。提示育肾助孕方可能通过降低p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白活化，减少卵巢颗粒细胞凋亡，抑制卵巢组织萎缩，改善DOR大鼠卵巢功能，减缓衰退进程，且育肾助孕方对卵巢功能的改善效果与其药物浓度有关。