沈凌宇,常雄飞,潘 良,杨 怡,刘晓静,王世广△,胡 慧△

(1.北京中医医院顺义医院，北京 101300；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是最为常见的女性生殖内分泌疾病，以稀发排卵、高雄激素及卵巢多囊化为主要表现。现在人们普遍认识到，胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是导致这种复杂疾病的关键因素之一[1]，临床上不仅60%～70%的PCOS患者存在超重或肥胖(与IR有密切关系)，许多体质量正常或偏瘦的患者体内也存在IR[2]。IR是细胞、组织或机体需要超过正常量的胰岛素才能正常反应的一种病理状态，其可从下丘脑、垂体、卵巢以及肝脏等多个层面增加体内游离雄激素水平[3]。近期研究表明NFκB介导的下丘脑炎症信号异常是下丘脑PI3K的通路障碍的原因之一[4]，而下丘脑PI3K异常是PCOS-IR及排卵减少的重要机制[5]。课题组前期研究发现针刺具有改善PCOS患者IR的作用[6]，本研究通过建立PCOS-IR大鼠模型，探讨电针对PCOS-IR下丘脑NFκB-IKBα-PI3K信号通路的调控作用，为电针治疗PCOS-IR的临床运用提供现代科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄雌性SD大鼠40只，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供[许可证号：SCXK(京)2016-0006]，北京中医药大学东方医院动物实验中心SPF级动物实验室饲养。饲养环境为温度(22±1)℃，相对湿度65%～70%，12 h明暗交替，自由进食水，自订购之日起适应性饲养3 d，实验过程经北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂 Glucose Kit[批号20190816，英科新创(厦门)科技有限公司]；insulin ELISA kit(批号80-INSRTU-E01，美国Alpco公司)； HRP标记山羊抗大鼠(批号GB23302，武汉赛维尔生物科技有限公司)；HRP标记山羊抗兔(批号GB23303，武汉赛维尔生物科技有限公司)；β-actin(批号GB12001，武汉赛维尔生物科技有限公司)；p65 Antibody(批号GB11142，武汉赛维尔生物科技有限公司)；IkB alpha(批号10268-1-AP，武汉三鹰生物科技有限公司)；Mouse Anti-PI 3 Kinase p85 alpha Monoclonal Antibody(批号bsm-33219M，北京博奥森生物科技有限公司)；4 %多聚甲醛(批号：BL539A，Biosharp生物)；苏木精-伊红染色液(批号：DH0003，北京化工厂)。

1.2.2 仪器 alphaEaseFC灰度分析软件(美国Alpha Innotech公司)；KWD-808-Ⅰ电针仪(常州英迪有限公司)；Φ0.22 mm×13 mm一次性无菌针灸针(北京中研太和有限公司)；全自动生化仪AU480(日本奥林巴斯株式会社)；电泳仪(北京六一仪器厂)；全自动多功能酶标仪(美国Thermo公司)；石蜡切片机(美国Thermo Scientific)；蜡块包埋仪(美国Thermo Scientific)。

1.3 造模与分组

将40只大鼠随机取6只为正常组，正常组大鼠以1 %羟甲基纤维素钠(CMC)溶液1 mL/100 g体质量灌胃，剩余大鼠经来曲唑造模，以相同浓度的CMC-来曲唑混悬液1 mL/100 g灌胃，来曲唑浓度为0.1 mg/mL，每日灌胃1次，持续灌胃21 d[7]。灌胃最后5 d进行大鼠阴道涂片，以大鼠阴道涂片失去周期性变化判定PCOS造模成功。PCOS造模成功的大鼠禁食8 h，眶静脉取血测定空腹血糖(FPG)及空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，以HOMA-IR>2.8作为PCOS-IR造模成功的评判标准[8]。筛选出造模成功的大鼠12只，模型组、电针组各6只。造模成功后，正常组大鼠持续予上述浓度CMC溶液1 mL/100 g灌胃，模型组及电针组大鼠持续予上述浓度的CMC-来曲唑混悬液保证模型的稳定性，持续至取材前1日。

1.4 干预方法

电针组大鼠装入自制避光袋，Φ0.22×13 mm针灸针直刺双侧“带脉”穴[9]3～5 mm，具体位置在大鼠脐水平第12肋的前下方，连接电针，选择疏密波2/100 Hz，具体强度维持在0.6～1.4 mA，每次持续20 min。正常组、模型组大鼠装入避光袋中20 min，无其他干预措施。每日1次，连续14 d。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 大鼠卵巢HE切片 取大鼠卵巢放入4 %多聚甲醛溶液中24 h，石蜡包埋后按6 μm厚度切片，苏木精-伊红染色后封片。

1.5.3 胰岛素抵抗水平检测 取材前各组大鼠禁食、不禁水8 h，每100 g腹腔注射0.3 mL 2%戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉采血5 mL，4 ℃，3 000 r/min离心20 min。取上清用氧化酶法测定空腹血糖(FPG)，用ELISA法测定空腹胰岛素(FINS)，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(IAI)，公式为：HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(m IU/L)/22.5；IAI=Ln(1/FPG×FINS)。

1.5.4 下丘脑NFκB、IKBα及PI3K蛋白表达检测 各组大鼠麻醉取血后，断头分离大脑，在冰浴上分离出下丘脑，放于-80 ℃保存，用于Western blot检测。将下丘脑加入蛋白酶抑制剂置入匀浆机中彻底匀浆，12 000 rpm离心10 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度。沸水浴变性后，10%分离胶 120 V，5%浓缩胶75 V电泳。后将蛋白25 V恒压转膜过夜，用5%的脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗(β-actin、p65 Antibody、IkB alpha、Mouse Anti-PI 3 Kinase p85 alpha Monoclonal Antibody)4 ℃孵育过夜，TBST室温摇床上洗3次×5 min，将二抗(HRP标记山羊抗大鼠1∶3 000、HRP标记山羊抗兔1∶1 000)室温孵育30 min，TBST室温摇床上洗3次×5 min。在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂等体积混合于PVDF膜上的蛋白充分反应，曝光后用显影、定影试剂进行显影和定影，将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢病理改变差异

正常组可见正常的卵泡及黄体；模型组卵巢体积增大，正常卵泡大多数被囊状卵泡取代，出现多囊样改变，卵泡膜层增厚，颗粒细胞层变薄；电针组可见正常卵泡，卵泡膜层较模型组薄，颗粒细胞层增厚。见图1。

注：A为正常组，B为模型组，C为电针组。图1 各组大鼠HE染色切片(20×)

2.2 各组大鼠WC、Lee’s指数及体质量增加率的变化

模型组WC、Lee’s指数及体质量增加率比正常组明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；电针干预后腰围、体质量增加率降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但仍高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠腰围、Lee’s指数及体质量增加率的比较

2.3 各组大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR及IAI的变化

各组大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR及IAI的变化见表2，模型组血清FPG、HOMA-IR、IAI与正常组相比明显上升，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，电针干预后FPG、HOMA-IR及IAI下降，差异具有统计学意义(P<0.01)，但治疗后FPG依旧高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.01)。说明针刺可改善来曲唑诱导的PCOS大鼠造成的胰岛素抵抗。

表2 治疗后各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR及IAI比较

2.4 各组大鼠下丘脑NFκB、IKBα及PI3K蛋白表达的变化

与正常组比较，模型组下丘脑NFκB蛋白表达增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，IKBα及PI3K蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，电针组下丘脑NFκB蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，IKBα及PI3K蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3、图2。

表3 各组大鼠下丘脑NFκB、IKBα及PI3K蛋白表达的比较

图2 各组大鼠下丘脑NFκB、IKBα及PI3K蛋白免疫印迹图

3 讨论

中医学认为多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗病机多肾虚，多痰湿，中焦在其中发挥着重要的作用，中焦运化失调则水液代谢失调而生膏脂，升降枢机失司则下不能滋肾水养胞宫，上不能益脑明神，致生殖轴异常。带脉位处中焦，是全身唯一一条横行经脉，对十二正经及其他奇经八脉起着维系的作用，“带脉”穴不仅对糖脂代谢有重要作用[10]，也用于治疗月经病，《针灸甲乙经》记载:“妇人少腹坚痛，月水不通，带脉主之”，本研究采用针刺“带脉”穴来治疗PCOS，主要基于对“带脉失约是PCOS不可忽视的病机之一”的认识[11]。

本研究关注PCOS-IR下丘脑转导通路主要基于以下原因：目前学界认为PCOS的发病机制与下丘脑-垂体-性腺轴功能失调、高雄激素血症及IR密切相关[12]，PCOS患者中IR患病率高达75%，其中许多是不依赖肥胖的方式存在的，其原因与下丘脑炎症状态有密切关系。PCOS-IR机制主要在于受体后水平，即信号向细胞内传导过程异常或参与传导的信号分子功能异常，其可以影响生殖功能的主要靶点也在下丘脑[13]。

既往研究表明来曲唑造模后大鼠进食量明显增加，过量饮食后，下丘脑处于促炎信号激活的状态，导致一种慢性和稳定的炎症背景，称为“下丘脑微炎症”[14]。下丘脑微炎症状态在体质量显著增加之前就已经改变了胰岛素敏感性[4]，NFκB是神经代谢性炎症的关键中介之一[15]，NFκB与抑制蛋白IKBα结合，处于抑制状态。IKBα的减少/消失将NFκB释放进入细胞核启动基因转录。NFκB的转录产物包括细胞因子及其受体、黏附分子和凋亡因子等，共同启动了炎症反应。NFκB可通过细胞因子信号传导抑制因子(AOCS3)与PI3K信号通路整合，从而导致葡萄糖代谢异常[16]，同时也会刺激GnRH调节生殖功能基因的表达[17]，加速LH释放，从而导致T增加，引起卵泡发育障碍[18]，触发PCOS的发生[19]。

本实验结果选取来曲唑造模的PCOS大鼠作为研究对象，研究结果表明经来曲唑灌胃后大鼠存在下丘脑微炎症及胰岛素抵抗状态，与Lian[20]的研究结果相一致。“带脉”穴是奇经八脉带脉所过之处，冲任督脉起于胞宫，皆络于带脉，从巡行上讲，带脉与脑及胞宫有密切联系，本实验电针“带脉”穴干预后，大鼠体脂参数、胰岛素抵抗指数及下丘脑NFκB、PI3K信号通路有一定改善，从实验角度佐证了古籍中“带之为病，腹满，腰溶溶如坐水中”以及“妇人少腹坚痛，月水不通，带脉主之”的论述，证实了针刺带脉对卵泡发育有一定作用，提示电针可通过改善下丘脑NFκB通路改善生殖轴功能，治疗PCOS-IR的潜在机制之一，与中药治疗相关疾病有异曲同工之妙[11, 20-21]。临床中PCOS-IR患者往往为带脉枢机受损、脾胃升降运化失司，聚痰生湿，痰湿循经下流胞宫，阻滞胞门造成肾水难达胞宫、经水闭塞不行，本研究为临床治疗该类患者取穴提供另一种思路。同时本研究初次从下丘脑微炎症的角度探讨电针治疗PCOS-IR的机制，为PCOS的治疗提供新的思路，而下丘脑炎症的产生可能与饮食增加导致肠道微生态失衡、肠道免疫异常有关[22]，这也是目前中医干预PCOS的潜在靶点[23]，其相关环节还有待进一步研究。