刘逸阳，邹 璟，黄国付

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.武汉市武昌医院，湖北 武汉 430063；3.武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022)

慢性腰痛是临床常见病及多发病，是全球范围内最常见的致残疾病之一[1]，已经成为了一个全球性的公共卫生问题。椎间盘退变是导致慢性腰痛的主要病因[2],健康的椎间盘是一种无神经血管的结构，椎间盘发生退变时，携带伤害性信息的神经纤维向椎间盘的内部生长，这可能是产生疼痛的原因[3]，这种因椎间盘本身退变造成的慢性腰痛称为盘源性疼痛。轴突导向因子在神经纤维内向生长中发挥了关键作用，它能够调节轴突的再生，同时发挥排斥和吸引双重信号作用，引导轴突到达正确的靶点[4]。在成人神经系统中主要有4类轴突导向家族表达，参与神经的再生和修复，分别是Netrins、Slits、Ephrins和Semaphorins，其中Netrin-1是Netrins家族中第一个被发现的具有双功能轴突导向信号的分泌型蛋白质[5]，可以通过与不同受体结合发挥吸引/排斥作用，促进/抑制神经纤维的长芽和延伸。

当前临床用以改善盘源性疼痛的方法以外科侵入式疗法和药物治疗为主，但外科侵入式疗法创伤大、费用高，其长期安全性和有效性还需要进一步的研究证据支撑[6]，而常见的用以治疗慢性腰痛的药物(如非甾体抗炎药和阿片类药物等)，虽然可以在一定程度上改善症状和延缓病情进展，但收益较为有限，长期服用存在较高的安全隐患和不良反应[6]。一系列的临床随机对照试验肯定了针灸疗法对椎间盘退变疾病的疗效[7-9]，同时基础研究也表明电针可以延缓椎间盘退变，促进脊髓中甲硫脑啡肽(M-ENK)和β-内啡肽(β-EP)的释放发挥镇痛作用[10-13]。在前期课题组研究发现，电针能够上调背根神经节(DRG)中Netrin-1的表达来抑制退变椎间盘神经纤维内向生长。本研究在前期研究的基础上进一步研究电针对脊髓背角中M-ENK、β-EP表达的影响及其与Netrin-1之间的相关性，探讨电针对改善慢性盘源性疼痛的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大白兔20只，5～6月龄，体质量3.0～4.0 kg，由武汉万千佳兴生物科技有限公司提供(动物合格证编号：No42000300005522)，于湖北中医药大学SPF级动物实验房分笼饲养，饲养条件：12 h明暗交替，温度20～25℃，相对湿度(50±10)%，规律饮食。在本研究中，对动物的处置遵循中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。实验动物适应性饲养3周后，根据随机数字表法将实验兔随机分为以下5组：正常组、模型组、假模型组、电针组和假电针组。

1.2 实验仪器与试剂

1.2.1 实验仪器 椎间盘施压器(东风制造厂)；电钻(上海锐奇)；针灸针(华佗牌)；韩式穴位神经刺激仪(南京济生有限公司)；电泳槽(北京六一仪器厂)；电转仪(北京六一仪器厂)；DG-3022A酶标仪(赛默飞世尔科技公司)；水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2.2 实验试剂 RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；TBST(国药集团化学试剂有限公司)；蛋白Marker(海利克思公司)；PVDF膜(Millipore公司)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司)；X光胶片(锐珂(厦门)医疗器材有限公司)；显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)。

1.3 动物造模方法与分组

所有实验兔适应性饲养3周后随机选取4只作为正常组，不予处理，正常饲养4周；其余实验兔参考Kroeber M[14]、黄国付等[11]的椎间盘退变造模方法进行造模，固定器固定实验兔，根据体质量配制10%水合氯醛(1 mL/kg)沿耳缘静脉注射麻醉,麻醉成功后俯卧位固定实验兔，背部进行备皮，在实验兔的L4、L5椎旁附近做直切口，止血钳钝性分离椎旁各肌肉组织，暴露椎体结构后，将直径约1.5 mm的克氏针分别从L4、L5两椎体中间钻入，待克氏针穿出对侧皮肤后缝合切口。在克氏针的两端安装垂直的连接杆并在连接杆之间安装弹簧装置。见图1～2。随机取出4只实验兔作为假模型组，不予轴向机械压力；对剩余实验兔的椎间盘施加轴向压力200 N，共持续4周。术后给予4×106单位青霉素肌肉注射常规抗感染治疗，1次/d，共治疗7 d。造模周期结束后拆除机械加压装置及克氏针，对实验兔的椎间盘进行MRI平扫，评估造模结果。最终造模成功的12只实验兔随机分为模型组、电针组及假电针组，每组各4只。

图1 椎体加压前模型兔

图2 椎体加压后模型兔

1.4 干预方法

电针组使用固定器固定模型兔后，取L4、L5双侧夹脊穴，腧穴定位参考《实验针灸学》[15]。使用1寸(0.30 mm×25 mm)一次性针灸针直刺夹脊穴约12～20 mm，捻转进针至出现针下沉涩感后，连接韩式电针治疗仪，同侧L4、L5夹脊穴连接同一输出电极，对侧夹脊穴连接另一输出电极，疏密波，频率2/15 Hz,强度1～2 mA，20 min/次， 1次/d，每周6次，连续6次为一疗程，共治疗4个疗程。见图3。假电针组取L4、L5双侧夹脊穴处针刺，并夹持电极，不予通电，余处理同电针组。

图3 模型兔电针治疗图

1.5 观察指标与检测方法

Western blot检测Netrin-1、M-ENK及β-内啡肽蛋白含量：干预结束后处死各组实验兔，取出实验兔L2背根神经节及脊髓背角组织，分装后存于-70 ℃冰箱备用。取出少量样本，提取组织中的蛋白，加200 μLRIPA裂解液裂匀浆，制备蛋白样品，测定蛋白样品浓度。将制备好的蛋白样品和蛋白MAKER加入电泳液中进行电泳分离，取出目的条带及凝胶，浸泡于电转缓冲液中，在转模槽中将蛋白转移至PVDF膜上。使用含5 %脱脂奶粉的TBST(封闭液)封闭PVDF膜，并将PVDF膜浸泡于稀释(稀释比例为1∶1 000)后的一抗(GAPDH)孵育液过夜后,使用TBST充分洗涤后，浸泡于稀释(稀释比例为1∶5 000)的二抗(HRP)孵育液中，室温摇床孵育2 h。使用TBST洗去多余的二抗后，将混合好的ECL显影液滴加于PVDF膜上，使用X光胶片进行显影，定影处理。冲洗、晾干和扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 退变腰椎间盘造模成功的标志

正常组椎间盘MRI呈均匀明亮的高信号，且椎间盘间信号比较差异无统计学意义。见图4。模型组退变椎间盘MRI呈不同程度的黑色低信号影，与正常椎间盘相比，信号差异比较有统计学意义。见图5。提示椎间盘退变造模成功。

图4 正常组椎间盘MRI

图5 模型组椎间盘MRI

2.2 各组实验兔DRG中Netrin-1蛋白表达比较

如表1所示，与正常组比较，假模型组DRG中Netrin-1的表达未见明显变化(P>0.05)，而模型组退变椎间盘相应DRG中Netrin-1蛋白表达明显下降(P<0.05);与模型组比较，电针组DRG中Netrin-1蛋白表达明显升高(P<0.05);与电针组比较，假电针组DRG中Netrin-1蛋白明显降低(P<0.05)。见图6。

表1 各组实验兔DRG中的Netrin-1蛋白相对表达量

图6 各组实验兔DRG中的Netrin-1蛋白相对表达量western blot检测比较

2.3 各组实验兔脊髓背角M-ENK、β-内啡肽蛋白相对表达量

如表2所示，与正常组比较，假模型组脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表达未见明显变化(P>0.05)，而模型组脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较，电针组脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表达明显增加(P<0.05);与电针组比较，假电针组脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表达明显减少(P<0.05)。见图7。

表2 各组脊髓背角中M-ENK、β-内啡肽蛋白相对表达量

2.4 Netrin-1与M-ENK、β-内啡肽蛋白表达的相关性

采用直线相关分析法分析正常组、模型组与电针组中Netrin-1、M-ENK和β-EP蛋白含量之间的相关性。结果发现,Netrin-1蛋白含量与脊髓背角M-ENK、β-EP之间均存在正相关性(R2=0.66、R2=0.51)。见图8～9。

图8 Netrin-1与M-ENK蛋白表达的相关性

图9 Netrin-1与β-EP蛋白表达的相关性

3 讨论

椎间盘作为脊柱运动的基本单元，承载着来自不同方向、不同程度的压力负荷，是脊柱中最易发生病变的结构[16]。健康椎间盘的髓核、纤维环深层以及软骨终板中无血管和神经纤维的分布，只在纤维环外1/3分布有来自背根神经节投射的神经纤维[17-18]，但椎间盘的神经支配并不一定与脊神经节段相一致，神经示踪法发现下位节段腰椎间盘由L2背根神经节中的神经元支配[19]。椎间盘退变时，神经纤维能够沿着裂缝向纤维环深层及髓核生长[3]，遭受退变椎间盘释放的化学炎症介质刺激或者椎间盘因生物力学失衡产生的机械刺激，这可能是导致盘源性腰痛的病理机制。

神经纤维向内生长过程中，轴突导向因子发挥着重要的作用，其能够调节轴突的再生，引导再生的轴突到达正确的靶点建立功能性神经回路[4]。Netrin-1作为双功能轴突导向因子，与不同受体结合能够促进/抑制感觉神经纤维的长芽和延伸。与结直肠癌(DCC)受体结合介导吸引轴突，与不协调受体(UNC5)结合介导排斥轴突。诱导Netrin-1发挥吸引/排斥作用主要依赖于细胞膜Ca2+通道以及胞浆内Ca2+释放来完成的[20]。当细胞膜上Ca2+通道的开放，胞浆内Ca2+内流，诱导Netrin-1发挥吸引作用，反之，则诱导Netrin-1发挥排斥作用。此外，离体实验发现外源性的Netrin-1能够降低环磷酸腺苷(cAMP)含量,抑制蛋白激酶A(PKA)信号传导通路，抑制Ca2+通道的开放，降低细胞内Ca2+水平，抑制成年大鼠DRG神经元突起的生长[21]。

疼痛是外周感受器接受化学或机械刺激后将信号传递至初级感觉神经元DRG，DRG接受刺激后产生动作电位，Ca2+通道的开放，促进Ca2+内流，同时携带伤害性递质以胞吐形式释放到突触间隙，并将兴奋传递至下一个神经元[22]。伤害性信息在DRG及脊髓背角完成转化和调制后传递至中枢产生痛觉。M-ENK、β-内啡肽属于内源性阿片肽，广泛分布于大脑、脊髓、外周感觉神经元及免疫细胞中[23]，作用于痛觉传导通路以达到镇痛的效果。内源性阿片肽与受体结合后，能够减少cAMP合成，抑制PKA信号传导通路，抑制Ca2+通道的开放，抑制Ca2+内流，降低细胞兴奋性[24-25]，抑制疼痛信息的传递。

电针能够作用于痛觉神经传导通路，通过抑制疼痛递质的释放来减少伤害性神经元的活动，进而缓解神经性疼痛[26]。同时，在CFA(完全弗氏佐剂)诱导的炎性疼痛大鼠模型的研究中，发现电针能够诱导淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞释放内源性阿片肽物质进入炎症部位，来抑制神经末梢痛觉信号的传递[27]。另外，电针夹脊穴能够改善局部肌肉痉挛状态，恢复脊柱的正常生物力学结构[28]，从而缓解对退变椎间盘的机械刺激。

本研究以腰椎间盘退变模型为载体，研究电针对退变椎间盘实验兔Netrin-1、M-ENK以及β-内啡肽含量的影响及两者之间联系。结果显示正常实验兔L2节段DRG中Netrin-1蛋白表达丰富，这是因为神经系统在发育过程中，DRG需要将轴突延伸至脊髓背角特定靶点建立神经通路，Netrin-1既要确定DRG轴突向脊髓背角延伸的时间，同时防止DRG轴突向脊髓背角异常投射[29]。由于在成年动物脊髓以及DRG中Netrin-1受体含量不同，抑制性受体UNC5的含量要远高于DCC受体[30-31]，当腰椎间盘退变时，DRG中Netrin-1的表达减少，对有髓神经纤维的内向生长的抑制作用下降，导致有髓神经纤维向椎间盘内部生长。电针的干预上调Netrin-1蛋白含量，但假电针组Netrin-1的含量未见增加。这与课题组前期的实验结果是一致的，电针能够通过上调退变椎间盘DRG中Netrin-1蛋白的表达，使脊髓背角中的生长环境变为抑制，抑制有髓神经纤维向椎间盘内部生长。在正常实验兔脊髓背角可见少量M-ENK、β-EP，这可能与内源性阿片肽在外周和中枢神经系统中都有广泛的表达有关。腰椎间盘退变后，实验兔脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白含量增加，究其原因，由于轴向机械压力诱导椎间盘退变，DRG相应节段的脊髓背角发生了炎症反应，激活M-ENK、β-EP的释放。电针干预能够进一步促进脊髓背角M-ENK、β-EP的合成与分泌，增加脊髓背角内源性阿片肽的含量，作用于疼痛传导通路，发挥镇痛作用。

Netrin-1与脊髓背角M-ENK、β-EP蛋白含量之间均呈正相关关系，提示脊髓背角M-ENK、β-EP可能参与电针诱导DRG中Netrin-1表达上调，从而抑制退变椎间盘有髓神经纤维内向生长，改善盘源性疼痛。本研究发现内源性阿片肽在电针上调Netrin-1表达的关键作用，这将有助于阐明电针治疗退变腰椎间盘疾病的可能机制，为临床应用电针防治退变腰椎间盘疾病提供一定的科学依据，但内源性阿片肽通过何种途径参与电针上调Netrin-1表达，有待进一步研究探讨。