刘慧娟,张佳琦,庄苏,周斌斌,李健,张莉莉,王恬,王超

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

宫内发育迟缓(IUGR)是指哺乳动物的胚胎或器官在母体子宫内受各种因素影响而发生一系列障碍的统称[1]。IUGR动物出生后表现为生长迟缓、发育异常、抗病力下降,早期发病率和死亡率较高,据统计,IUGR新生儿个体发生率约占妊娠数5%～10%,而在中国发生率甚至更高[2]。IUGR还可通过“胎儿程序化”作用长期影响出生后存活仔猪的生长发育及健康。在现代畜牧业中IUGR已成为一个亟待解决的重要问题[1-3]。仔猪肝脏是受到IUGR影响的一个重要组织器官[4],IUGR可损坏断奶仔猪肝脏抗氧化能力,引起氧化损伤[5],并可导致仔猪肝脏脂代谢紊乱,甚至诱导脂肪肝的产生[6]。但至今为止鲜有关于IUGR“胎儿程序化”作用对猪肝脏组织影响的研究报道。

姜黄素(curcumin,Cur)是一种从姜科植物姜黄中提取的天然多酚类物质,是姜黄中主要的活性成分,为橙黄色,在烹饪和医学领域都受到了广泛关注[7]。姜黄素本身具备多种营养活性和药理功能,如抗氧化、抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗糖尿病、抗病毒,降血脂和增强免疫等多种作用[8]。其中姜黄素的抗氧化机制可能与Nrf2信号通路有关[9],它可以通过诱导Nrf2而介导HO-1基因的上调表达,减轻二甲基亚硝胺所诱导的大鼠肝损伤[10]。姜黄素可促进IUGR动物生长发育,提高机体抗氧化功能,减少IUGR诱导的大鼠或仔猪氧化损伤,缓解氧化应激[11-12],且日粮添加姜黄素可抑制肝脏脂质生成,显著降低大鼠血清总胆固醇和LDL-C含量,上调HDL-C含量,提高肝脏功能,减少脂质蓄积,改善肝脏糖脂代谢[13]。因此,我们推测姜黄素可能对IUGR猪肝脏功能也具有一定调控作用,但目前姜黄素的应用研究多集中在IUGR仔猪方面,而对IUGR猪生长后期肝脏发育及抗氧化和脂代谢功能研究较少,故本试验通过日粮添加姜黄素从抗氧化和脂代谢两方面系统研究其对(26～195日龄)IUGR猪的作用效果,并从Nrf2信号通路及脂肪合成与分解方面探讨其潜在作用机制,为IUGR猪的饲养及姜黄素的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组处理

根据先前的研究[14],择取分娩时间与遗传背景相近的妊娠母猪12头,于分娩当日从每窝新生仔猪(杜长大)中分别选择1头正常出生重(NBW,约1.51 kg)、2头IUGR仔猪(约0.75 kg),新生仔猪采取母乳喂养方式。26日龄断奶并将所选仔猪分为NBW、IUGR和IUGR+Cur组3组,每组6个重复,每重复 2头猪,NBW和IUGR组猪断奶后饲喂基础日粮,IUGR+Cur组饲喂基础日粮+200 mg·kg-1姜黄素处理,处理时间为169 d(26～195日龄)。基础日粮(粉料)参照美国国家研究委员会(NRC 2012)推荐营养水平配制,其组成及营养成分见表1。所用姜黄素(纯度≥98%)由广州科虎生物技术研究开发中心提供,添加剂量参照我们课题组前期研究[15]。试验期内,猪断奶分组后均饲养于同一圈舍的水泥地板上,自由采食和饮水,每重复(2头)养于一栏。期间按猪场饲养管理要求进行驱虫和常规免疫,并观察和记录动物的健康状况。

表1 基础日粮组成和营养组成水平

1.2 样品采集

在试验结束时(195日龄),分别从每组选择6头猪(每重复随机选择1头),禁食12 h,电击后放血致死,屠宰,采集部分肝脏样本用4%多聚甲醛固定、石蜡包被后进行组织冷冻切片、染色,用于肝脏形态观察。另取部分肝脏样本放置冻存管内,液氮迅速冷冻后置于-80 ℃低温冰柜储存备用。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 肝脏组织形态观察取厚度为10 μm的冰冻切片肝脏样本置于冰浴福尔马林溶液固定10 min;固定后的切片用蒸馏水洗涤3次,然后置于无水丙二醇5 min,60 ℃油红O染色10 min,加85%丙二醇分化 5 min,蒸馏水洗涤3次;苏木素浸染30 s,流动自来水冲洗3 min;最后加甘油明胶封片。肝脏切片经油红O染色后置于光学显微镜(ECLIPSE 80i型,日本尼康)观察拍照,用Image J 图像分析软件测定油红O染色面积(%)。脂肪组织呈橘红色至红色,细胞核呈为蓝色,细胞间质不着色。

1.3.2 肝脏组织抗氧化与脂代谢相关指标测定取肝脏约160 mg,按1∶9(质量∶体积)的比例加入预冷的生理盐水,冰水浴条件下匀浆破碎90 s,匀浆液以3 000 r·min-1(5804R,德国Eppendorf公司)、4 ℃下离心15 min,上清液贮存于-20 ℃用于后期相关指标测定。总蛋白含量采用BCA法测定,总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

1.3.3 目的基因mRNA表达量测定取冻存的肝脏组织样品约100 mg,用Trizol试剂(TaKaRa,大连)提取总RNA。检测RNA的质量和浓度后,将提取的不同样品的RNA浓度用DEPC水统一稀释成500 ng·μL-1,最后反转录cDNA。反转录的反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s,最后降温至4 ℃。采用TaKaRa SYBR®PremixExTaqTM定量试剂盒进行荧光定量PCR。反应体系的总体积为10 μL,包括:5 μL ChamQ SYBR qPCR主混合物(2×),0.2 μL正、反向引物,0.2 μL ROX Reference Dye 1(50×),1 μL cDNA 和 3.6 μL 超纯水。反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s,40个循环。熔解曲线反应:95 ℃ 15 s;60 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s。以β-actin作为内参基因,用2-ΔΔCT法计算各基因mRNA的相对表达量。引物序列见表2。

表2 实时荧光定量PCR所用引物序列

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 日粮中添加姜黄素对IUGR猪肝脏相对质量的影响

由图1可知,猪肝脏相对质量在NBW、IUGR及IUGR+Cur组之间均无显著性差异(P>0.05),提示日粮添加200 mg·kg-1姜黄素对IUGR猪肝脏发育无明显促进作用。

图1 姜黄素对宫内发育迟缓(IUGR)猪肝脏相对质量的影响

2.2 日粮中添加姜黄素对IUGR猪血清和肝脏抗氧化性能的影响

由表3可知:与NBW组相比,IUGR猪血清和肝脏中CAT活性和GSH含量显著降低(P<0.05),T-SOD活性和MDA含量无显著性差异(P>0.05);与IUGR组相比,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素显著降低IUGR猪血清和肝脏中MDA含量(P<0.05),提高T-SOD、CAT活性及GSH含量(P<0.05),并显著提高IUGR猪肝脏GSH-Px活性(P<0.05)。与NBW组相比,IUGR+Cur组猪肝脏中T-SOD和GSH-Px活性显著提高(P<0.05)。提示日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可缓解IUGR诱导的猪肝脏氧化应激。

表3 姜黄素对IUGR猪血清和肝脏组织抗氧化指标的影响

2.3 日粮中添加姜黄素对IUGR猪肝脏组织抗氧化基因表达水平的影响

由图2可知:与NBW组相比,IUGR猪肝脏中CATmRNA相对表达量显著下降(P<0.05);与IUGR组相比,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素使IUGR猪肝脏GST、CAT、HO-1以及GSH-Px和Nrf2mRNA表达量均显著增加(P<0.05),而对SODmRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。与NBW组相比,IUGR+Cur组GST、SOD、HO-1、GSH-Px以及Nrf2mRNA表达量均显著增加(P<0.05),而CATmRNA表达量在2组之间无显著差异(P>0.05)。推测日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可能增强IUGR猪肝脏组织Nrf2信号通路。

图2 姜黄素对IUGR猪肝脏抗氧化基因表达量的影响

2.4 日粮中添加姜黄素对IUGR猪血清和肝脏脂代谢水平的影响

由表4可知:与NBW组相比,IUGR猪血清和肝脏中TG水平显著增加(P<0.01),HDL-C与LDL-C水平无显著差异(P>0.05);与IUGR组相比,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素显著降低了IUGR猪血清和肝脏中TG水平(P<0.05),提高了IUGR猪肝脏中HDL-C水平(P<0.05)。与NBW组相比,IUGR+Cur组猪血清和肝脏中TG、LDL-C水平无显著差异(P>0.05),但肝脏中HDL-C水平显著增加(P<0.05)。提示日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可改变IUGR猪肝脏脂代谢功能。

表4 姜黄素对IUGR猪血清和肝脏脂质代谢指标的影响

2.5 日粮中添加姜黄素对IUGR猪肝脏脂质沉积(油红O染色)的影响

由图3可知:与NBW组相比,IUGR猪肝脏细胞质及细胞间隙含有密集脂肪滴,表明存在严重的脂质沉积现象,且脂质空泡充满细胞质中,油红O染色面积显著增加(P<0.05)。与IUGR组相比,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素使IUGR猪肝脏细胞质中脂滴减少,油红O染色面积显著降低(P<0.05)。而NBW与IUGR+Cur组之间油红O染色面积无明显变化(P>0.05)。提示IUGR猪肝脏中存在脂质沉积现象,而姜黄素能够降低IUGR猪肝脏中的脂质沉积。

图3 姜黄素对猪肝脏脂质沉积(油红O染色)的影响

2.6 日粮添加姜黄素对IUGR猪肝脏脂代谢相关基因表达量的影响

由图4可知:与NBW组相比,IUGR猪肝脏中PLINmRNA的表达量显著升高(P<0.05);与 IUGR 组相比,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素使IUGR猪肝脏中PLINmRNA的表达量显著降低(P<0.05),HSL、ATGL与LPLmRNA的表达量显著提高(P<0.05)。与NBW组相比,IUGR+Cur组中PLINmRNA表达量无显著性变化(P>0.05),HSL、ATGL与LPLmRNA的表达量均显著提高(P<0.05)。提示日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可调节IUGR猪肝脏脂代谢相关基因mRNA的表达。

图4 姜黄素对IUGR猪肝脏脂代谢相关基因表达量的影响

3 讨论

3.1 日粮添加姜黄素对IUGR猪肝脏抗氧化相关酶活性和基因表达量的影响

抗氧化酶是一种存在于细胞环境中的蛋白质,它能通过调控抗氧化酶活性及数量来清除体内自由基[16]。当肝脏中有过量脂肪沉积并超出本身代谢水平后,常伴随抗氧化酶表达下调而引起氧化应激[17]。氧化应激主要由活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等引起的氧化还原功能紊乱,导致脂质和蛋白质氧化以及DNA和细胞损伤[18]。已有证据表明,IUGR可导致胎儿肝脏氧化应激,它可能与自由基积累和细胞适应性抗氧化能力之间的不平衡有关[19]。GSH本身含有巯基易氧化,能够快速有效清除体内过多的自由基,其作为评价机体氧化应激状态的重要指标是衡量机体抗氧化能力的重要因素[20]。CAT是一类能够催化氧化还原反应的氧化还原酶,也是动物机体防御体系的重要保护酶[21]。MDA是反映机体内源性脂质过氧化的重要指标[22]。本试验结果显示,195日龄IUGR猪肝脏相对质量与NBW猪无显著差异,这可能与IUGR猪在断奶后期出现补偿生长有关。尽管IUGR猪体重及部分器官质量在生长后期可出现补偿生长,但其机体健康及组织功能仍与NBW猪存在一定差异[23]。与前期研究结论相同[24],本试验中,IUGR猪血清、肝脏中GSH水平及CAT活性均显著下降,说明IUGR猪肝脏中存在一定程度的氧化应激。前人研究发现IUGR仔猪肝脏中GSH含量和CAT活性显著降低,MDA含量增加[25],本试验结果与之相似,但MDA含量无显著变化,或许是由于IUGR猪肝脏在断奶后出现补偿生长,从而改善IUGR猪肝脏发育及脂质过氧化现象。而日粮添加200 mg·kg-1姜黄素使IUGR猪血清和肝脏中MDA含量显著降低,GSH含量和T-SOD、CAT活性以及肝脏中GSH-Px活性显著增加,但对肝脏相对质量无显著影响,说明姜黄素可以改善由IUGR造成的抗氧化酶活性的降低,这与Yan等[26]研究发现日粮添加姜黄素使115 日龄猪肠道中MDA含量显著下降,T-SOD活性显著增加的结果相似。T-SOD和GSH-Px作为一线抗氧化酶,可催化O2-转化为H2O2,再进一步还原为H2O,从而提高机体的抗氧化能力[27]。因此,本试验结果提示,日粮(26～195日龄)添加200 mg·kg-1姜黄素可通过提高IUGR猪抗氧化能力有效缓解肝脏氧化应激。

为进一步探讨日粮添加姜黄素缓解IUGR猪肝脏氧化应激的作用机制,我们分析了肝脏中SOD、GST、CAT、HO-1及Nrf2等基因mRNA的表达。Nrf2是一个重要的转录因子[28],与HO-1等抗氧化基因mRNA表达密切相关[10],它可通过控制相关抗氧化基因表达来调控抗氧化防御系统[29],当Nrf2激活与抗氧化反应元件结合后,开启抗氧化酶基因的表达,进而促进一系列抗氧化酶的合成[30]。本试验中IUGR猪显著抑制了肝脏中CAT基因的表达,该结果与IUGR猪血清和肝脏中CAT活性下降一致。而日粮添加200 mg·kg-1姜黄素则显著增强了IUGR猪肝脏中Nrf2基因的相对表达量,并上调CAT、GST、HO-1和GSH-Px相关抗氧化基因的表达,这与Gao等[31]研究发现姜黄素发挥其抗氧化作用的潜在机制是通过激活Nrf2上调相关基因(HO-1、NQO1)相对表达量来实现的结果相似。从对大鼠和小鼠模型研究中也发现,日粮添加姜黄素可以提高GST和CAT基因的表达量[11,32]。结合本试验结果推测,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可能通过激活Nrf2通路来提高IUGR猪肝脏抗氧化功能,缓解氧化应激。这一结果与胡戈等[33]研究发现日粮中添加姜黄素可以上调氧化应激状态下大鼠肝脏内Nrf2及HO-1表达水平,改善相关抗氧化酶活性,有效缓解大鼠肝脏氧化应激状态的结果一致。Sahin等[34]也证明添加姜黄素可以改善鹌鹑的热应激反应,增强Nrf2和HO-1的表达,减少机体的氧化损伤。

3.2 日粮添加姜黄素对IUGR猪肝脏脂代谢的影响

在动物脂质代谢过程中,肝脏与体内脂质代谢密切相关[35],其在脂质消化、吸收、合成、分解与运输中均具有重要作用。肝脏组织中的脂肪主要是甘油三酯,若肝脏中多余的脂肪酸转化形成脂滴过多地积聚在肝脏内,则易导致肝细胞膨胀,引发脂肪肝[36]。临床上常以TG、HDL-C、LDL-C为基础指标检测肝脏脂质水平,油红O染色面积与脂滴含量呈显著正相关,它是评估组织中脂质沉积程度的主要标志之一[37]。本试验结果显示,IUGR猪血清和肝脏中TG水平显著高于NBW组,油红O染色面积显著增加,说明IUGR猪肝脏中存在过量的脂质沉积。据报道,姜黄素能够使Ⅱ型糖尿病小鼠血浆中TG水平和高脂饲喂大鼠肝脏中甘油三酯含量显著降低[38]。而在本试验中,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素显著降低了IUGR猪血清和肝脏中TG水平及油红O染色面积,提高IUGR猪肝脏中HDL-C水平,而LDL-C水平则无显著差异,这与Yiu 等[13]研究发现姜黄素可显著提高大鼠血清中HDL-C水平的结果一致。此结果提示,日粮添加姜黄素能够通过改善肝脏中甘油三酯代谢来缓解IUGR诱导的195日龄猪脂质代谢紊乱及减少肝脏中TG沉积现象。Niu等[39]研究也发现日粮中添加姜黄素能够抑制IUGR猪肝脏脂质合成,加速肝脏脂质分解,我们的结果与之相同。

ATGL和HSL在脂质分解中起主要作用,当机体ATGL缺乏会导致脂质水平下降[40]。LPL在乳脂合成中对脂肪酸的摄取和转运具有重要调控作用。PLIN基因为细胞内脂滴相关蛋白,它在组织中广泛表达,对脂肪组织中TG储存具有重要作用[41],PLIN在非磷酸化状态下存于脂滴表面,防止机体内甘油三酯水解,促进脂质沉积[42]。在本试验中,IUGR猪与正常猪肝脏中的HSL、ATGL以及LPL表达量无明显变化,但IUGR猪肝脏中PLIN基因的表达量显著升高,说明195日龄IUGR猪肝脏中存在脂质沉积现象。有研究发现IUGR胎儿期肝脏质量减轻,脂代谢异常[43],成年期表现为肝脏脂质沉积增加,甚至可导致脂肪肝的出现[44]。而日粮添加200 mg·kg-1姜黄素可显著降低猪肝脏中PLIN基因表达量,同时增强HSL、ATGL与LPLmRNA表达量,这与我们得到的IUGR+Cur组猪血清和肝脏中TG含量及肝脏油红O染色面积显著降低的结果一致。秦培洁等[45]发现添加姜黄素能够有效缓解Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏脂质代谢,减少脂质在肝脏中过度沉积。结果提示,日粮添加姜黄素缓解IUGR猪肝脏脂质过度沉积可能是通过降低PLIN基因表达量,增强ATGL基因表达从而抑制脂质合成并促进脂质分解以减少肝脏中TG含量来实现。

综上所述,日粮添加200 mg·kg-1姜黄素(26～195日龄)可能通过Nrf2信号通路增强IUGR猪肝脏抗氧化功能,缓解氧化应激;并通过调控PLIN与ATGL基因的表达,抑制脂质合成,促进脂质分解以缓解IUGR猪肝脏脂质过度沉积现象。