李菲,户倩,翟怡雯,陈发棣,蒋甲福

(南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)原产于我国,为菊科菊属多年生宿根草本花卉,是世界重要盆栽、切花和地被花卉,具有很高的观赏和经济价值。观赏花卉的花期对其观赏价值及经济价值至关重要。菊花多为短日照品种,于秋季开放。为最大限度地开发菊花的观赏价值,满足市场的周年供应,挖掘与菊花成花转变相关的新基因对开展菊花的花期育种意义重大[1-2]。

蛋白质异戊二烯化是一种蛋白质翻译后修饰作用,由法尼基蛋白转移酶(FTase)或牻牛儿酰牻牛儿基蛋白转移酶Ⅰ和Ⅱ(GGTase-Ⅰ和GGTase-Ⅱ)催化,向蛋白质结构添加法尼基或牻牛儿酰牻牛儿基2种聚异戊二烯基团的过程。在拟南芥中,ENHANCED RESPONSE TO ABA(ERA1,At5g40280)编码法尼基的β亚基,ERA1基因之所以如此命名,是因为该基因的敲除突变体在种子萌发和气孔关闭试验中对脱落酸(ABA)的反应增强[3-4]。在突变体era1中,ABI3的表达上调,侧根增多,植物的抗旱性增加[5]。有报道称这种对ABA的超敏反应是由于era1中油菜素甾醇(BR)合成受阻而间接引起的[6],CYP85A2(CaaX=CSPY)经过异戊二烯化后能够准确靶向在内质网间隔中,从而促进油菜素内酯生物合成的最后一步。近期的研究表明,法尼基转移酶能通过介导BRI1-EMS-SUPPRESSOR1(BES1)的表达以及BES1蛋白的降解参与BR信号的转导,在era1突变体中BES1蛋白的积累能够导致BR信号的增强[7]。

ERA1还能通过法尼基转移酶对腺苷磷酸-异戊烯基转移酶(IPT)的修饰,参与细胞分裂素的合成。类异戊二烯细胞分裂素生物合成途径的第一步中,AMP/ADP/ATP与二甲基烯丙基二磷酸反应生成相应的异戊烯基腺苷-5磷酸,随后代谢为单磷酸盐。腺苷磷酸酯的异戊烯化由IPT催化。在拟南芥中,IPT蛋白由7个基因家族编码(AtIPT1和AtIPT3—AtIPT8)。其中AtIPT3含有法尼基转移酶典型的CaaX=CLVA识别序列,表明该蛋白是蛋白法尼基转移酶(PFT)的底物[8]。

法尼基转移酶对BR信号通路的调控是ERA1参与开花调控的一种方式,另一种则是通过法尼基转移酶的底物,HSP40蛋白J3实现的[9]。J3是连接光周期和温度路径的枢纽,J3在长日照下受昼夜节律的调节被诱导,能够在长日照条件下促进下游基因SUPPRESSOROVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、FLOWERINGLOCUST(FT)的表达,促进开花,同时J3能与SHORT VEGETATIVE GROWTH(SVP)互作并参与调控开花的过程[10]。拟南芥中花分生组织特征基因AP1也是法尼基转移酶的底物,这些表明ERA1在光温协同调控开花的过程中起到重要的作用[11]。

在拟南芥中,计算机辅助数据库搜索已经鉴定出119种潜在的法尼基转移酶底物蛋白,它们在DNA结合和转录调节,依赖GTP的信号传导过程,细胞周期调节,细胞壁修饰,植物花期调控与花发育等生物和非生物反应中起着重要作用[12-14]。而在菊花中编码法尼基蛋白转移酶亚基的基因功能还未见报道。本文从菊花品种‘神马’克隆了ERA1同源基因CmERA1,对其进行生物信息学分析,分析其组织表达特异性及响应光周期的表达变化,为其功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为菊花品种‘神马’,由南京农业大学中国菊花种质资源保存中心提供。所用烟草为本氏烟草(Nicotianabenthamiana)。

1.2 基因克隆

1.2.1 总RNA的提取及第1链cDNA的合成取菊花‘神马’叶片,经液氮速冻后手动研磨。采用北京华越洋公司的RNA提取试剂盒提取菊花叶片总RNA后,用核酸仪检测其浓度,经计算后取总RNA 1 000 ng,用PrimeScriptTMRT reagent(with gDNA Eraser)反转录试剂盒(TaKaRa公司)反转录。

1.2.2CmERA1基因的克隆在菊花‘优香’转录组数据(登录号:SRP076366)中检索法尼基转移酶β亚基序列,以此设计全长扩增引物并合成。以菊花‘神马’cDNA为模板,由Phusion高保真DNA聚合酶催化全长扩增反应。

1.3 系统进化树构建和序列分析

使用NCBI的BLASTp工具筛选出18条CmERA1同源序列。用DNAMAN 6.0软件进行多序列比对以及进化分析。使用ExPASy ProtParam tool在线工具(https://web.expasy.org/protparam/)对蛋白相对分子质量、等电点等理化性质进行分析。使用SOPMA和Phyre 2对蛋白的二级结构进行预测。

1.4 CmERA1转录激活活性分析

使用内切酶EcoRⅠ和SalⅠ(TaKaRa公司)构建酵母单杂交系统pGBKT7-CmERA1载体。测序结果显示正确后将质粒pGBKT7-CmERA1、阳性对照pCL1、阴性对照pGBKT7分别转化酵母Y2H菌株。带有阳性质粒pCL1质粒的菌液涂布于缺陷培养基SD/-Leu,带有阴性质粒及pGBKT7-CmERA1的菌液涂布于缺陷培养基SD/-Trp,30 ℃条件下暗培养3 d。将菌落转移至包含/不包含X-α-Gal成分的SD/-Ade/-His培养基上,若包含pGBKT7-CmERA1质粒的菌落与阳性对照一样在SD/-Ade/-His+X-α-Gal上显蓝色,则具有转录激活活性。

1.5 CmERA1亚细胞定位

使用内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对CmERA1ORF产物和pORE-R4空载体进行双酶切并连接,构建带有融合绿色荧光蛋白的GFP标签载体:pORE-R4-CmERA1。通过农杆菌转化法,将分别含有pORE-R4-CmERA1、P19、带有融合红色荧光蛋白OsD53-mCherry的菌液暗培养3 h后,注射叶龄为3周左右的烟草叶片。注射后烟草植株暗培养过夜,而后转至光照/黑暗时间为16 h/8 h的培养室中培养48 h,随后在激光共聚焦显微镜下观察核定位信号以及绿色荧光信号。

1.6 菊花CmERA1基因的启动子克隆

在甘野菊的基因组公共数据库(http://mum-garden.kazusa.or.jp/cgi-bin/blast.cgi,Cse_sc000677.1)查到CmERA1的启动子序列,使用Primer Premier 5.0设计引物克隆并测序后,使用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对菊花CmERA1基因启动子序列进行分析。

1.7 组织定量分析

分别取有8～10片展开叶且处于营养生长时期和生殖生长时期的野生型菊花‘神马’的根、茎、叶片(从上至下第5片叶)、顶芽、舌状花、管状花样本,液氮速冻并手动研磨后提取总RNA并反转录为cDNA备用。每个样本设3个生物学重复。

1.8 长日照和短日照条件下CmERA1表达模式分析定量

采集生长状况良好的野生型‘神马’的插穗扦插于基质中(蛭石与营养土体积比3∶1),放置于光照/黑暗时间为16 h/8 h、温度为22 ℃、相对湿度为65%～70%的人工气候培养室中培养。待长至10片成熟叶时,选取长势一致的植株分别移至生长温度为22 ℃的长、短日照光照培养箱中。长日照处理的光照/黑暗时间为16 h/8 h,短日照处理的光照/黑暗时间为8 h/16 h。预培养1周后,以开始光照处理为ZT(zeitgeber time)0,每隔4 h取样1次,取样时间持续2个生物钟周期,即ZT48。取样部位为从上至下第3片完全展开叶,每个时间点设3个生物学重复,液氮速冻并手动研磨后提取总RNA并反转录为cDNA备用。

1.9 菊花CmERA1基因的表达量测定及分析

根据测序所得CmERA1全长序列设计荧光定量PCR引物,在甘野菊的基因组公共数据库中查到CmCO的序列并设计荧光定量PCR引物(表1),以1.3和1.4节中反转录所得cDNA模板,进行PCR扩增以鉴定定量引物是否可用。使用Eppendorf Real Time PCR荧光定量仪,以CmEF1α的扩增产物作为内参,设3个技术重复。相对表达量采用2-ΔΔCT的方法[15]计算。

表1 本研究所用的引物

2 结果与分析

2.1 菊花CmERA1基因的克隆

根据菊花的转录组数据(登录号:SRP076366),克隆所得菊花中法尼基转移酶β亚基序列,开放阅读框为1 356 bp,共编码451个氨基酸,命名为CmERA1(图 1-A)。进一步用NCBI保守结构域工具对其氨基酸序列进行预测,显示该蛋白属于ISOPREN_C2_like超级家族成员,第14～449位氨基酸处有保守的PLN02710结构域。使用ExPASy ProtParam tool对其氨基酸的性质进行分析,显示CmERA1相对分子质量为50.0×103,理论pI为5.12。其中亮氨酸(Leu)和丝氨酸(Ser)在全部氨基酸中比例较高,分别为10.2%和9.8%。该蛋白脂肪指数为81.29,亲水性平均指数为-0.322,预测其为亲水性蛋白。菊花 CmERA1与其他18个物种的ERA1蛋白进化分析结果(图1-B)表明,CmERA1与青蒿的蛋白亲缘关系最近,其次是向日葵,而与拟南芥的亲缘关系较远,暗示法尼基转移酶β亚基在菊科植物中进化较为保守。

图1 CmERA1基因的克隆(A)与不同物种中ERA1的系统进化分析(B)

2.2 CmERA1蛋白质二级结构分析

利用 SOPMA网站对 CmERA1蛋白的二级结构进行分析,其蛋白主要由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链构成,比例分别为47.67%、42.67%、4.88%和4.88%(图2)。

图2 CmERA1蛋白二级结构预测

2.3 CmERA1转录激活活性分析

酵母单杂交系统验证转录激活活性试验结果(图3)显示,所有质粒均能够在单缺陷培养基SD/-Leu或SD/-Trp上生长。含有阳性对照pCL1质粒的菌落能够在SD/-Ade/-His缺陷培养基上正常生长,且在X-α-Gal+SD/-Ade/-His培养基中变蓝。含有阴性对照质粒pGBKT7及含有质粒pGBKT7-CmERA1的菌落无法在SD/-Ade/-His缺陷培养基上生长,也无法在X-α-Gal+SD/-Ade/-His培养基中变蓝(图3)。这表明CmERA1编码的蛋白没有转录激活活性。

图3 CmERA1转录激活活性分析

2.4 CmERA1亚细胞定位

在激光共聚焦显微镜下可见,阳性对照定位于细胞膜和细胞核,CmERA1则定位于细胞核中(图4)。

图4 35S∷GFP-CmERA1在烟草亚细胞的定位

2.5 CmERA1启动子元件分析

在CmERA1启动子区域序列设计引物,以‘神马’DNA为模板进行克隆,得到CmERA1的ATG上游启动子序列2.0 kb(图5)。由图6可见:CmERA1基因启动子含有脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、分生组织表达元件CAT-box和典型的CAAT-box和TATA-box元件,并含有Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motif等多种光响应元件和参与光响应的顺式作用元件。

图5 菊花CmERA1基因启动子的克隆

图6 CmERA1基因启动子所含元件模型图

2.6 CmERA1基因表达模式分析

2.6.1 组织特异性表达分析由图7可见:在营养生长时期,CmERA1在不同组织中表达量由高到低依次为叶、茎、茎尖、根;在生殖生长时期,在不同组织中表达量由高到低依次为根、叶、管状花、茎、叶、舌状花。

图7 菊花CmERA1在营养生长时期(A)和生殖生长时期(B)各组织的表达量

2.6.2 不同光周期下的表达变化以响应昼夜节律的光周期路径关键基因CmCO为对照,对CmERA1进行节律表达模式分析。由图8可见:CmCO在不同光周期下的表达具有明显的节律性。在长日照条件下,CmERA1对昼夜节律的响应不明显;在短日照条件,CmERA1在一天的开始(ZT0)以及一天的结束(ZT24)表达量达到峰值;在开始日照后第4小时(ZT4)表达量达到谷值。据此推测CmERA1可能参与光周期调控菊花开花过程。

图8 CmERA1和CmCO在长日照(LD)和短日照(SD)条件下的表达模式分析

3 讨论

光周期路径、春化路径、温度路径、年龄路径、自主路径和赤霉素路径是拟南芥中主要的6条开花路径[16]。在拟南芥中,法尼基转移酶参与调控开花的是其推定靶标J3(CaaX=CAQQ)介导的光周期路径[9,16-18]。ERA1敲除突变体era1-2具有花期推迟、莲座叶和花瓣数随机增加的表型,与J3的法尼基缺陷突变体j2/j3+J3C417S的开花表型相同[9]。而J3在长日照下受昼夜节律的调节被诱导,促进下游基因SOC1、FT的表达从而促进开花[9]。菊花是短日照植物,受短日照的诱导而开花[19]。CONSTANS(CO)是光周期路径的核心基因[20]。本研究表明,CmCO在菊花‘神马’中的表达也具有明显的节律性。以CmCO为参考,对CmERA1在不同光周期下的表达分析表明,在短日条件下CmERA1响应昼夜节律。这与CmERA1启动子中具有Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motif等多个光响应元件相符。这些暗示了CmERA1可能参与光周期调控菊花开花的过程。

本研究中,CmERA1的启动子中还包含分生组织特征元件CAT-box、响应水杨酸的元件TCA-element和响应ABA信号的元件ABRE。在拟南芥中,法尼基转移酶既可以修饰IPT3(CaaX=CLVA)调节营养生长时期的植物发育,也可以修饰AP1(CaaX=CFAA)调节生殖生长时期的花发育[8,11]。本研究组织定量分析中,营养生长时期CmERA1在茎尖的表达量远高于在根中的表达量,而在生殖生长时期,CmERA1在舌状花和管状花中的表达量则远远低于根中的表达量,这暗示着CmERA1负调控菊花的花芽分化。

本研究从‘神马’菊花中克隆获得编码法尼基转移酶β亚基的CmERA1全长序列,其与同为菊科的青蒿中的ERA1基因亲缘关系最近,序列相似性高达93.53%,暗示其功能保守。CmERA1蛋白不具有转录激活活性,在细胞中定位于细胞核,说明其主要在细胞核中发挥作用。关于CmERA1基因其余功能是否像在拟南芥中一样保守,是否能够通过修饰J3而介导菊花的开花过程,还待后续的研究验证。总之,本研究为研究‘神马’菊花CmERA1基因调控开花的功能奠定了基础。