张志凌,王凯,张茹,徐晴玉,罗光华*,方继朝

(1.南京农业大学植物保护学院,江苏 南京210095;2.江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地),江苏 南京210014;3.扬州大学园艺与植物保护学院,江苏 扬州 225009)

Halloween家族基因参与昆虫蜕皮激素合成,昆虫蜕皮激素/蜕皮酮(ecdysone,E)是其生命过程中的重要激素之一,其发挥功能的活化形式是20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)。20E参与昆虫的蜕皮、化蛹变态发育、成虫羽化和生殖等生命过程,当蜕皮激素滴度水平异常时,昆虫的生长发育会出现异常[1-3]。Peng等[4]对小菜蛾(Plutellaxylostella)的研究显示,Halloween家族基因Cyp314a1被干扰后,试虫体内的20E滴度显著降低,个体发育历期延长、化蛹率降低;个体的卵黄原蛋白和卵黄原蛋白受体基因表达显著降低,产卵量也显著减少。赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的Cyp314a1基因被干扰后,卵黄原蛋白基因表达量显著降低[5]。果蝇(Drosophilamelanogaster)和家蚕(Bombyxmori)的蜕皮激素合成基因Cyp306a1被干扰或突变后,试虫体内20E的滴度显著降低并且变态发育异常[6-7]。

昆虫蜕皮激素是其生长发育过程中的重要激素之一,合成蜕皮激素的一系列基因统称为Halloween家族基因。蜕皮激素由Halloween家族基因利用昆虫从食物中获取的植物甾醇或动物胆固醇来合成[8-9]。已经发现的Halloween家族基因有:spook(Spo,Cyp307a1)、phantom(Phm,Cyp306a1)、disembodied(Did,Cyp302a1)、shadow(Sad,Cyp315a1)和shade(Shd,Cyp314a1)等。Cyp307a1参与7-脱氢胆固醇(7-dehydro cholesterol)至三脱氧蜕皮酮(2,22,25-trideoxyecdysone)的合成,Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1协同将三脱氧蜕皮酮转变为无活性的蜕皮酮/蜕皮激素(E),以上过程在昆虫前胸腺细胞中完成;蜕皮酮(E)释放至血淋巴中,Cyp314a1将无活性的蜕皮酮(E)催化形成具有生物学功能的20-羟基蜕皮酮(20E),该过程在昆虫周缘组织中完成[10-11]。其中,7-脱氢胆固醇至三脱氧蜕皮酮的具体催化合成过程并没有完全明确,有待深入研究。

二化螟(Chilosuppressalis)是水稻上的常发性重大害虫,由于其钻蛀性为害,很难有效防控,并且其已对多种药剂产生高水平抗性[12-14]。从生长发育调控角度出发,研发新的二化螟防控药剂以及探寻新的防控策略,对于二化螟的有效防控具有现实意义。目前,二化螟Halloween家族基因的研究尚不全面,在NCBI数据库中进行基因检索,发现二化螟Halloween家族基因中Cyp302a1和Cyp315a1在数据库中尚没有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。同时,二化螟Halloween家族基因5个成员的时空表达谱未见详细研究,功能研究方面也未见报道。本研究对Cyp302a1和Cyp315a1基因进行了完整转录本序列的克隆,并且分析了二化螟Halloween家族5个基因的时空表达谱特征,为后续深入研究Halloween家族基因的功能及二化螟生长发育调控机制提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

二化螟试虫是在室内利用人工饲料[15-16]连续传代饲养多年的品系。饲养条件:温度(28±1)℃,相对湿度70%～80%,光/暗培养时间为16 h/8 h。

1.2 样本收集

利用12孔板单头饲养二化螟试虫,从初孵幼虫开始,收集每个龄期的每个日龄1次样本。初孵至 3龄,由于个体小,收集的是群体样本(15～30头);从4龄开始,收集单头样本。每个收样节点收集3组样本,作为3个生物学重复。此外,在冰上解剖二化螟5龄幼虫60头,分别收集头、中肠、表皮、脂肪体样本。每份组织样本收集3组,作为3个生物学重复。所有样本经液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存,用于后续总RNA的提取。

1.3 总RNA提取与cDNA模板制备

利用Promega公司的总RNA提取试剂盒(SV Total RNA Isolation System Kit)分别提取各样本的总RNA。提取方法根据试剂盒的使用说明书进行。提取完成后利用12 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,并利用Nano-Drop 1000分光光度计检测其浓度。

总RNA经检验合格后,进行cDNA模板第1链合成。采用TaKaRa公司的反转录试剂盒PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(大连宝生物工程有限公司)进行cDNA第1链合成,具体操作方法依据试剂盒说明书进行。cDNA模板于-20 ℃冰箱保存,用于反转录PCR(RT-PCR)的扩增。利用TaKaRa公司反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)制备用于时空表达模式分析的cDNA模板。具体操作方法依据试剂盒说明书进行,模板制备完成后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 基因克隆

基于二化螟Cyp302a1和Cyp315a1基因已知的核酸序列片段,分别设计用于5′和3′的cDNA末端快速扩增(RACE)的特异引物(表1)。RACE扩增利用Clontech公司的RACE试剂盒参照说明书进行操作。以二化螟各龄期幼虫的混合总RNA为模板制备RACE模板,于-20 ℃冰箱保存备用。

表1 本研究所用引物

PCR扩增产物用15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检测,将潜在目标产物条带切胶回收后连接到T3(pEASY-T3 Cloning Kit,北京全式金生物技术有限公司)克隆载体上,再转化至Trans1-T1感受态细胞中,随机挑选6个单克隆,经LB培养基振荡培养并进行菌液检测确认后,送至上海生工生物技术有限公司进行双向测序。

通过RACE扩增分别获得目标基因完整转录本的5′端和3′端序列,经过拼接后再设计每条基因完整转录本的End-to-End扩增引物(表1)。所用扩增酶为TaKaRa公司的LATaq酶(Premix Taq LATaqVersion 2.0 plus dye),50 μL扩增体系,具体操作方法按照说明书。所有目标PCR产物进行测序验证。

1.5 序列分析

测序结果利用GeneDoc 2007软件(http://www.nrbsc.org/downloads/)进行序列比对。利用NCBI网站上的ORF Finder工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析目标序列的ORF框,同时获得对应的氨基酸序列。利用NCBI网站上的在线软件CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对氨基酸序列保守结构域进行预测。利用NCBI网站上的BLAST程序(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与GenBank中的nr数据库进行同源序列搜索。基于获得的不同物种的同源基因氨基酸序列利用MEGA 7.0软件[17]构建分子进化系统发育树,构建方法为最大似然法(maximum likelihood method,ML),各分支 bootstrap 值设定为1 000。

1.6 二化螟Halloween家族基因时空表达模式分析

利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测二化螟Halloween家族基因在二化螟不同发育时期和不同组织的表达水平。RT-qPCR采用TaKaRa公司的TB Green Premix ExTaqⅡ试剂盒(Tli RNaseH Plus),按照操作说明书进行,扩增体系为20 μL。扩增反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40个循环。内参基因为延伸因子(EF1α),引物序列见表1。目标基因的相对表达量采用2-ΔCT法计算。

1.7 统计分析

基因表达量显著性差异统计分析:使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA);在假定方差齐性参数条件下利用LSD法进行多重比较差异分析。

2 结果与分析

2.1 二化螟2个Halloween家族基因的序列及特征

基于二化螟基因组和转录组数据,通过RT-PCR和RACE技术成功克隆获得二化螟Halloween家族基因的Cyp302a1(disembodied,Did)和Cyp315a1(shadow,Sad)基因完整转录本序列。二化螟的Cyp302a1完整转录本长1 707 bp,5′端有62 bp非编码区(untranslated region,UTR);3′端有52 bp的UTR,其中polyA尾含26个A碱基;含1个开放阅读框(ORF),长1 593 bp,编码530个氨基酸,命名为CsCyp302a1(GenBank登录号:MZ848381)。二化螟的Cyp315a1完整转录本长1 659 bp,5′端UTR长115 bp;3′端UTR长71 bp,polyA尾含32个A碱基;含1个ORF,长1 473 bp,编码490个氨基酸,命名为CsCyp315a1(GenBank登录号:MZ848382)。

多重序列比对分析表明,CsCyp302a1氨基酸序列与烟草天蛾(Manducasexta)、斜纹夜蛾(Spodopteralitura)和家蚕(Bombyxmori)的Cyp302a1氨基酸序列相似性均在75%以上。CsCyp315a1氨基酸序列与亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、烟草天蛾、家蚕和大蜡螟(Galleriamellonella)的Cyp315a1氨基酸序列相似性均在75%以上。CsCyp302a1和CsCyp315a1与其他昆虫相应的家族成员基因一样,均具有5个保守结构域:WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),其中“x”代表任意氨基酸,表明CsCyp302a1和CsCyp315a1都是典型的线粒体酶(图1、2)。

图1 二化螟Cyp302a1及其他昆虫氨基酸同源序列多重比对

基于氨基酸序列的分子系统发育进化分析显示:对于Cyp302a1,二化螟与大蜡螟、烟草天蛾以及家蚕在系统发育进化树中关系较近,聚为一支;二化螟Cyp315a1与亚洲玉米螟、烟草天蛾、家蚕以及大蜡螟的在系统发育进化树中关系近并聚为一支。二化螟Halloween家族基因成员,在系统进化聚类分析中均与其他昆虫相应的同源序列聚在一起,进一步证明本研究所克隆的基因属于Halloween家族基因对应的家族成员。表明昆虫Halloween家族基因各成员在不同昆虫体内都有较高的保守性,各个基因均各自聚成一簇(图3)。

2.2 二化螟5个Halloween家族基因时空表达模式

二化螟不同发育阶段的实时荧光定量PCR分析显示,Halloween家族基因成员的表达都有各自的特点(图4)。5个基因都在5龄阶段处于高水平表达状态,但不同基因在5龄不同日龄时达到最高表达水平。在5龄阶段从低日龄到高日龄,Cyp307a1基因表达量逐渐上升;Cyp306a1基因表达量逐渐下降;Cyp302a1基因表达量先下降再上升然后再下降,中间阶段处于最高水平;Cyp315a1基因表达量在末日龄快速上升;Cyp314a1基因表达量前期总体低于后期。

二化螟5个Halloween家族基因全生育期的总体相对表达水平:Cyp307a1基因的相对表达量在这 5个基因中最高,Cyp315a1基因的相对表达量在这5个基因中最低。每个基因的表达都呈现波动状,在二化螟各个龄期转换前后节点处,Cyp307a1基因表达水平呈现升高状态,其他4个基因的表达水平无明显的规律。Cyp306a1基因在1龄前期呈现明显的高表达状态。Cyp314a1基因在2龄中后期与3龄前期呈现明显的高表达状态(图4)。

图2 二化螟Cyp315a1及其他昆虫氨基酸同源序列多重比对

图3 基于氨基酸序列构建的昆虫Halloween分子系统发育树(最大似然法)

图4 二化螟Halloween家族基因不同发育时期表达模式

二化螟5龄幼虫不同组织的实时荧光定量PCR分析显示,Halloween家族基因成员在4种不同组织中的表达有较大差异(图5)。Cyp307a1基因在头部的表达量最高,极显著高于其他组织;Cyp306a1基因在中肠中的相对表达量最高,显著高于其他组织;Cyp302a1在头部和表皮中的表达量极显著高于中肠和脂肪体组织;Cyp315a1在头部和表皮中的表达量显著高于中肠和脂肪体;Cyp314a1基因在脂肪体中的相对表达量与在表皮中的表达量无显著差异,但显著高于头和中肠组织。

图5 二化螟5龄幼虫Halloween家族基因在不同组织中的表达模式

3 讨论

蜕皮激素是调控昆虫生长发育过程中的重要激素之一,Halloween家族基因参与合成蜕皮激素从而调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程[8-9,18]。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到二化螟蜕皮激素合成途径Halloween家族基因的CsCyp302a1和CsCyp315a1完整转录本序列。各基因与各个家族成员都有较高的序列相似性。基于氨基酸序列的同源基因多重比对以及分子系统进化发育分析结果显示,CsCyp302a1和CsCyp315a1分别与各自的Halloween家族基因成员聚为一支,表明本研究所克隆的基因是二化螟的Halloween家族基因成员。昆虫体内Halloween家族基因的研究比较广泛,果蝇、烟草天蛾、家蚕等均有研究报道,序列比对分析显示不同物种的同源基因均有很高的保守性[8-9,19-20]。Halloween家族基因成员在序列结构上的保守性,表明该类基因在进化过程中的生物学功能较为保守,也暗示不同昆虫的蜕皮激素合成与调控机制具有较大的相似性[6,8,21]。

对昆虫Halloween家族基因不同发育阶段表达模式的研究,鲜有从昆虫个体初孵至蛹的全发育过程检测分析。本研究检测了二化螟Halloween家族基因的5个主要成员从初孵至蛹的基因表达水平,结果显示各基因的表达伴随着不同龄期的蜕皮过程呈波动状态,但无明显的周期规律性,这与其他昆虫中的研究有相似之处但也存在差异[4,9,12,18]。白背飞虱(Sogatellafurcifera)从2龄至4龄伴随个体蜕皮,spook(Cyp307a1)基因表达水平呈明显的周期性变化[22]。烟草天蛾末龄阶段的不同发育日龄,Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1基因的表达在前期和后期均出现2个峰[23],二化螟这4个基因的表达在末龄不同日龄无此现象,表明不同昆虫之间Halloween家族基因的表达模式存在差异。褐飞虱(N.lugens)和海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)Halloween家族基因在幼虫末龄阶段的表达变化趋势与其体内的蜕皮激素滴度变化趋势相适应[18-19]。二化螟体内蜕皮激素的滴度动态变化未有详细研究,可以推测二化螟Halloween家族基因的表达变化也应当与其体内的蜕皮激素滴度变化相匹配,相关研究有待进一步深入。

蜕皮激素还参与昆虫的生殖等重要生命过程[4,8,24-26]。昆虫幼虫末龄是由幼虫阶段向蛹或成虫阶段转变的关键时期,这期间涉及个体生殖相关的细胞、组织等生长发育过程[4,24-25]。二化螟Halloween家族基因在末龄阶段的表达均有一个显著上升的过程,并且比其他幼虫龄期的总体表达水平都高。由此推测,末龄阶段蜕皮激素除了需要保障个体的正常化蛹需求外,还需要满足个体的生殖发育需求,相关研究结果在多种昆虫中已有报道。黑腹果蝇在末龄进入预蛹之前,蜕皮激素滴度呈现急速升高的状态且显著高于其他幼虫阶段,但与卵期的滴度水平相当[27]。在沙漠飞蝗、烟草天蛾、赤拟谷盗幼虫末龄后期体内蜕皮激素滴度均出现快速升高的状态[9,28-30]。Halloween家族基因被干扰后卵黄原蛋白和卵黄原蛋白受体基因表达量显著降低,生殖细胞发育异常,产卵量明显减少[4-5,9]。Halloween家族基因在二化螟生殖过程中的作用尚未有研究,本研究结果为进一步在二化螟体内开展这方面的研究奠定了重要基础。

Halloween家族基因家族成员共同参与昆虫体内蜕皮激素的合成,各个基因在不同时期、不同组织的表达变化不完全协同一致。Rewitz等[23]对烟草天蛾的研究显示,Cyp306a1在5龄中后期以及成虫初期的前胸腺内表达水平较高,其他时期和其他组织中表达量均很低;Cyp302a1在5龄第7日龄和成虫第1日龄时,在多种组织中均处于较高表达水平;Cyp315a1在5龄第3日龄时,在前胸腺内表达水平处于高位,但在其他时期和其他组织中均低水平表达[9]。研究表明,小菜蛾体内的Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1在前胸腺中表达量均很高,但Cyp314a1在前胸腺中表达量却很低;相反,Cyp314a1在脂肪体中表达量很高,而Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1在脂肪体中表达量均很低[4]。海灰翅夜蛾S.littoralis与小菜蛾相似,海灰翅夜蛾的Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1在前胸腺中表达量也很高,但Cyp314a1在前胸腺中表达量很低[19]。本研究发现二化螟体内Halloween家族基因成员在不同组织中的表达同样存在较大差异,与其他昆虫的研究结果相似。蜕皮激素合成过程中,无活性的蜕皮酮(E)是在昆虫前胸腺内由Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1和Cyp315a1合成[8-9],本研究显示二化螟Cyp307a1、Cyp302a1和Cyp315a1基因在头部(前胸腺所在位置)表达处于高水平状态,与已有研究结论一致;Cyp306a1基因在头部的表达并不是处于高表达状态,反而是中肠组织中表达水平最高,这是否意味着Cyp306a1基因在中肠中还发挥其他生物学功能,有待进一步研究。无活性的蜕皮酮(E)在周缘组织中由Cyp314a1基因将其转变成有生物活性的20-羟基蜕皮酮(20E)[10-11],本研究中Cyp314a1基因在二化螟不同组织中表达水平差异较小,这与已有研究结论一致。此外,二化螟Cyp302a1和Cyp315a1基因在表皮中相对表达水平高,但Cyp307a1和Cyp316a1基因在表皮中相对表达水平低,这种表达差异进一步表明,Halloween家族基因家族成员除了参与昆虫的蜕皮过程,还参与其他诸如生殖等生物学过程[4-5],而且在不同组织中发挥的作用也很可能存在差异,这些有待更深入的研究。本文的研究结果为深入开展二化螟蜕皮激素功能的研究奠定了重要基础。