王云飞 张昊 杨美欣 雒丽丽 徐进 许景升 冯洁 陈万权

摘要 为建立快速、稳定的南方镰孢Fusarium meridionale特异性检测方法，对已报道的镰孢属reductase-like基因部分序列进行比对分析，寻找特异性SNP位点，设计出特异性检测引物F-Fm/R-Fm3。利用该引物对包括南方镰孢在内的30株镰孢的基因组DNA进行PCR扩增。结果显示仅在7株南方镰孢中均扩增出400 bp左右的特异性条带。PCR灵敏度试验结果表明该方法的检测灵敏度达到500 pg基因组DNA。

关键词 镰孢属; 特异性检测; 南方镰孢

中图分类号： S432.44，S435

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020700

Abstract In order to establish a rapid and stable PCR detection method for Fusarium meridionale，the partial reductase-like gene sequences from F.meridionale were analyzed by alignment to screen specific SNPs and a pair of specific primer （F-Fm/R-Fm3） were designed according to the specific SNPs. With the specific primers， the genomic DNAs of 30 strains from 21 Fusarium species， including Fusarium meridionale etc.， were amplified by PCR. The results revealed that a specific amplicon of approximately 400 bp was amplified from seven strains of F. meridionale， while no amplicon was amplified from other 23 control strains and their negative control groups. Moreover， the sensitivity of this method reached 500 pg genomic DNA.

Key words Fusarium; specific detection; Fusarium meridionale

在世界范围内镰孢属Fusarium真菌可以引起包括玉米、小麦、水稻等多种农作物病害，不仅会造成农作物产量损失，品质降低，还会产生单端孢霉烯毒素等有毒次级代谢产物，对人和动物造成安全隐患，同时也会影响农产品产业健康发展[15]。在我国由镰孢引起的赤霉病、穗腐病在小麦、玉米产区的发生越来越频繁，造成了严重的经济损失，对我国主粮生产造成严重威胁[6]。据Zhou等[7]报道在中国重庆地区采集的116个玉米穗和籽粒腐烂样品中分离的镰孢分离株中，南方镰孢Fusarium meridionale被鉴定为主要真菌之一。据张昊等[8]报道南方镰孢F.meridionale也是引起我国小麦赤霉病的病原菌之一。

目前鉴定南方镰孢主要采用多位点基因分型法和EF1a基因序列分析法，但是这2种方法成本较高、耗时较长[913]。而特异性PCR检测技术在真核生物的分类方面也有较好效果，相较于传统的植物病原分类方法主观、复杂，而且难以准确地分析和鑒别近似种和种内生理小种、致病型间的差异等不足之处，其具有快速、准确、重演性好的优点。目前已经成为植物病原检测的重要技术[1419]。镰孢菌的某些基因序列，如reductase-like序列、EF序列等，在种内菌株之间有较高的保守性，但在属间和属内不同种间却大不相同，有着丰富的多态性，常用于镰孢菌系统进化分析。利用这一性质设计特异性引物来进行分子检测是目前被广泛接受的一种技术[2022]。本研究的目的在于设计F.meridionale种的特异性PCR扩增引物，利用分子检测方法，更高效准确地鉴定该镰孢种，用以监测该种的种群分布及动态变化。

1 材料与方法

1.1 材料

30株供试菌株相关信息见表1。

1.2 镰孢菌基因组DNA的提取

刮取适量菌丝于2 mL灭菌离心管中，真空冷冻抽干24 h后加入一个玻璃珠和适量石英砂在MiniBeadbeater-96研磨仪中研磨90 s。使用OMEGA公司的真菌基因组DNA提取试剂盒D3390-02提取DNA。

1.3 特异性PCR引物的设计

利用Geneious 11.0.4软件对GenBank中已报道的包括南方镰孢在内的多种镰孢菌的reductase-like基因序列 （GenBank登录号见表1）进行比对分析，发现南方镰孢在序列的第802位存在一个单核苷酸多态性位点 （SNP）（图1）。根据该SNP位点，利用Primer Premier 5设计特异性PCR引物F-Fm/R-Fm1。为了提高引物特异性，在反向引物中引入错配位点，将反向引物3′端第3位碱基（与比对序列的第804位互补）C分别替换为T、G、A，形成反向引物R-Fm2、R-Fm3和R-Fm4，用于特异性筛选。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 PCR反应体系与程序

PCR反应体系 （25 μL）：DNA模板1 μL， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，无菌水9.5 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min;94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;最后72℃延伸10 min;10℃保存。

1.5 引物特异性检验

以表1中所列参照菌株进行特异性检验，用设计的特异性PCR引物F-Fm/R-Fm1、F-Fm/R-Fm2、F-Fm/R-Fm3、F-Fm/R-Fm4分别进行扩增，反应体系及程序同1.4，其中181506、181571、181513、181514为本实验室采集分离并已经通过TEF1α基因序列分析鉴定为南方镰孢。超纯水代替基因组DNA为模板设为阴性对照，用1.2%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，结合结果选择最优引物进行引物灵敏度检验。

1.6 引物灵敏度检验

利用核酸浓度测定仪（GE公司，NanoVue Plus）将提取到的南方镰孢基因组DNA按照10倍稀释梯度，由5 ng/μL依次稀释至5 fg/μL，然后利用步骤1.5中筛选的引物对7个浓度基因组DNA进行PCR扩增，以水为阴性对照，用1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。

2 结果与分析

2.1 特异性PCR引物

根据Geneious软件中Fusarium spp.的reductase-like基因序列的比对分析结果，设计了用于南方镰孢检测的特异性PCR引物F-Fm/R-Fm1、F-Fm/R-Fm2、F-Fm/R-Fm3、F-Fm/R-Fm4（表2），根据引物设计可知，目的片段为400 bp左右。

2.2 引物特异性检验

以表1中菌株的基因组DNA为模板，利用设计的4对引物分别进行PCR扩增，电泳检测结果如图2所示，所有引物均可从南方镰孢基因組DNA中扩增出一条大小为400 bp左右的清晰电泳条带。但未引入错配碱基的引物F-Fm/R-Fm1在F.mesoamericanum、锐顶镰孢F.acuminatum、拟轮枝镰孢F.verticillioides、早熟禾镰孢F.poae、F.langsethiae、弯角镰孢F.camptoceras的基因组DNA中扩增出其他非特异性条带（图2a）。引入错配碱基T的引物F-Fm/R-Fm2在F.acaciae-mearnsii的基因组DNA中扩增出其他非特异性条带（图2b）。引入错配碱基A的引物F-Fm/R-Fm4在锐顶镰孢的基因组DNA中扩增出其他非特异性条带（图2d）。引入错配碱基G的引物F-Fm/R-Fm3，除南方镰孢基因组DNA外，其他菌株的基因组DNA均未扩增出任何片段（图2c）。特异性检测结果显示，引物F-Fm/R-Fm3具有最优的种间特异性，能够区分南方镰孢与Fusarium 属内其他菌株。

2.3 引物灵敏性检验

琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物条带亮度随模板浓度降低而变暗，模板量为500 pg时还能分辨出1条约400 bp的特异性条带（图3），而模板量小于500 pg时电泳条带消失，同时无菌水对照组均无电泳条带产生，说明该引物的灵敏度为500 pg。

3 讨论

植物病原真菌的准确鉴定和早期检测是植物病害防治的关键，目前PCR分子检测技术在植物真菌病害鉴定过程中得到越来越广泛的应用，曹月霞等[18]设计了两对特异性引物W106R/W106S和FOW-4F/FOW-4R，建立了一个双重PCR体系，能够准确、快速检测出尖孢镰孢菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.niveum。Yang等[19]根据CTPS2和TEF1α基因内的SNPs，设计了2套复合引物，能够在一个PCR反应内鉴定出禾谷镰孢F.graminearum和亚洲镰孢F.asiaticum。Suzuki等[17]根据tri6和tri3基因设计了8条引物，在一个反应内能同时鉴定出F.graminearum与 F.asiaticum及二者的毒素类型。目前已知镰孢属真菌包含多个复合种，以禾谷镰刀菌复合种Fusarium graminearum species complex （FGSC）为例，现阶段研究表明其中至少包含16个种，若仅仅利用形态学方法很难将其全部区分开来，潘逸等[6]利用PCR分子检测技术，设计了布什镰孢F.boothii的特异性引物，在包含全部FGSC在内的28个镰孢种中仅F.boothii产生特异性条带，且灵敏度高，可以有效鉴定该种。因此PCR检测技术用于镰孢属物种的鉴定是很有必要的。

Reductase-like基因常用于镰孢菌系统进化分析，其序列在镰孢种内十分保守[23]。本研究通过序列比对，发现F.meridionale中reductase-like基因存在稳定的特异性单核苷酸多态性位点。可利用该位点开发特异性检测引物。常规PCR技术检测单个碱基差异存在特异性较差的问题。吴亚君等[24]研究显示，引物3′端碱基错配对非特异性扩增反应发生有显著影响，3′端单一碱基错配可较大程度地降低非特异性扩增的发生，但同时也降低了扩增效率造成灵敏度下降。Wu等[25]提出了一种评价引物扩增能力的方法，其将引物中特定位置碱基替换成其余3种碱基后得到一系列新引物，新引物再与模板进行非特异性扩增，发现碱基错配位置对PCR反应扩增效率有较大影响，其中3′端3-4位错配对扩增效率没有显著影响。Birdsell等[26]研究发现在引物设计过程中，在引物3′端第3位设计错配碱基可以有效减少非特异性扩增。

李金春等[27]以错配反应与正常反应之间的ΔCt值为指示，发现碱基错配种类对聚合酶链式反应的非特异性扩增有显著影响，并呈现出较强的规律性。黄可[28]在对临床上18S rRNA序列同源性较高的巴贝斯虫Babesia spp.以及泰勒虫Theileris spp.进行分子区分时发现，引物3′端碱基由C变为A，以及由G变为C时，扩增效率最差。由T变为C以及由A变为C时，扩增效率最好。为减少本试验中非特异性扩增条带的产生，增强引物的特异性，本研究在特异性引物设计过程中，将其3′端第3个碱基C分别替换为T、G、A形成错配碱基，分别进行PCR扩增，结果显示引物中错配碱基可以有效减少非特异性扩增条带的产生，且不同错配碱基影响不同，其中碱基C替换为碱基G对非特异性扩增的抑制作用要优于替换为碱基A、T。与黄可的试验结果不同，可能是由于所鉴定物种不同，针对不同碱基对非特异性扩增的影响还有待进一步深入研究。

本研究利用Geneious、Primer Premier 5等软件进行比较分析，设计合成了1对用于检测南方镰孢的特异性PCR引物F-Fm/R-Fm3。并利用包括标准菌株在内的30株镰孢菌菌株基因组DNA对该引物进行检测，检测结果显示：在所有检测的基因组DNA中仅仅从南方镰孢基因组DNA中扩增出400 bp的特异性条带，从而证明F-Fm/R-Fm3引物对于南方镰孢的基因组DNA具有稳定性强、特异性高等优点，能够准确鉴定该菌种，相对于测序等方法，其低成本的特点适用于其大规模群体组成鉴定。

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（责任编辑：杨明丽）