林艾佳 吴奇 倪瑞莲 陈恒 卫冕 李成云 王一

摘要 稻瘟病严重威胁全球水稻的产量，钙离子信号通路参与了稻瘟菌生长、发育和致病，了解这些过程中菌株细胞质中钙离子浓度的变化对稻瘟病的防治具有重要意义。GCaMP6s作为一种细胞质钙离子感受蛋白在动物和植物中已有大量应用。本研究利用不同稻瘟菌菌株构建了GCaMP6s基因的异源表达菌株，在0.01 g/mL钙离子处理下，GCaMP6s在稻瘟菌菌丝和分生孢子中稳定表达。此外，GCaMP6s异源表达菌株与野生型菌株的菌落直径和产孢量没有差异，表明GCaMP6s基因的异源表达不影响稻瘟菌的菌丝生长和产孢。本研究获得了GCaMP6s异源表达的稻瘟菌菌株，为后续研究稻瘟菌细胞质中钙离子浓度变化与菌株生长发育和胁迫响应提供研究材料。

关键词 稻瘟菌; 异源表达; GCaMP6s

中图分类号： S435.111.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021023

Abstract Rice blast caused by Magnaporthe oryzae is a serious threat to the global rice production. Calcium signaling pathway is involved in the growth， development and pathogenicity of M.oryzae. Understanding the changes of Ca2+ concentration in the cytoplasm of M.oryzae at three different stages is of great significance for control of rice blast. As a cytoplasmic Ca2+ sensor protein， GCaMP6s has been widely used in animals and plants. In this study， heterologous expression strains containing GCaMP6s were constructed using M.oryzae YN153 and YN157 strains. Under 0.01 g/mL Ca2+ treatment， GCaMP6s was stably expressed in the mycelia and conidia of M.oryzae. In addition， by comparing the colony diameter and sporulation between the heterologous expression strains of GCaMP6s and the wild type strains， we found that there was no difference between the two strains， indicating that the heterologous expression of GCaMP6s gene did not affect the mycelial growth and sporulation of M.oryzae. In this study， we obtained the heterologous expression of GCaMP6s in M.oryzae， which can provide research materials for further study on the changes of calcium ion concentration in the cytoplasm， and the growth， development and stress response of M.oryzae.

Key words Magnaporthe oryzae; heterologous expression; GCaMP6s

細胞内游离钙是重要的第二信使，在生物体生长发育、转录调控、细胞代谢等方面具有重要作用[1]。近年来有关钙离子的报道在动植物和微生物免疫研究方面较多。在真核微生物中，钙离子钙调蛋白钙调磷酸酶（calcium-calmodulin-calcineurin）级联通路对病原真菌生长发育，特别是其毒力和侵染能力具有重要影响[2]，与病原真菌钙离子稳态、胁迫响应、细胞壁完整性等关系密切。例如，在链格孢Alternaria alternata中，钙调磷酸酶基因Cna1影响菌丝形态和分生孢子成熟[3];在大丽轮枝菌Verticillium dahliae中钙调磷酸酶基因Crz1与菌核形成相关[4]。此外，在玉米黑粉菌Ustilago maydis和核盘菌Sclerotinia sclerotiorum中细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1， Cdk1）通过调控钙离子的浓度控制菌株有丝分裂，最终影响了菌株的有性生殖能力[56]。在对寄主侵染能力的研究方面，钙调磷酸酶基因Crz1调控稻瘟菌Magnaporthe oryzae和灰葡萄孢Botrytis cinerea附着胞形成，该基因缺失后造成菌株侵染能力显著降低[78]。由于稻瘟菌在生长发育和侵染机制等方面有许多植物病原真菌所共有的特点，且较易开展遗传分析，因此，稻瘟菌可作为研究丝状真菌生长发育和侵染、致病机制的模式生物[9]。随着稻瘟菌基因组测序的完成，钙离子信号相关基因得到鉴定，推动了稻瘟菌中钙离子信号通路的研究。MoCCH1和MoMID1是钙离子信号传递中的关键基因，张弘敲除这两个基因后发现菌丝生长缓慢，产孢量下降，并且表现为对酸敏感[10];MoCMK1基因编码一个推定的钙离子/钙调蛋白依赖性激酶，该基因的缺失导致菌株致病力降低[11];He等研究了MoCMKK2基因，发现基因缺失突变体与野生型相比，分生孢子的产孢量明显增加，但是营养生长、分生孢子的萌发、附着胞的形成以及对水稻的致病性等均无明显变化[12]。gzslib202204041218

近年来，钙离子指示蛋白（genetically encoded Ca2+ indicator， GECIs）成为应用最广泛的钙离子细胞成像工具之一，在研究生物体不同组织、系统的生理功能和发育机制方面做出了重要贡献[13]。但仍存在一些问题，例如其响应速度较慢，对钙离子浓度响应范围有限等。Nakai等于2001年构建了一种钙离子指示蛋白GCaMPs，相较于早期的GECIs，这种蛋白具有不易降解，荧光强度高，钙离子浓度响应范围大等优点[14]。随后GCaMP2～GCaMP5相继出现，在黑腹果蝇Drosophila melanogaster和哺乳动物神经细胞中成功应用。目前，钙离子响应蛋白已经发展到GCaMP6，并在斑马鱼Danio rerio、果蝇和小鼠Mus musculus体内成功表达用于观察钙离子介导的神经元活性[15]。GCaMPs系列蛋白主要由3部分构成，包括圆环排列的绿色荧光蛋白cpGFP（circularly permuted green fluorescent protein）、钙调蛋白CaM（calmodulin）和与钙调蛋白互作的M13肽段组成。发光基团包裹在cpGFP中，而CaM-M13复合体位于发光基团一侧。当细胞中钙离子与钙调蛋白结合后，CaM-M13复合体构象发生变化，进而使发光基团外露绿色荧光增强。因此对各个亚基氨基酸的改造，增强对钙离子结合的灵敏度和提高荧光亮度一直是GCaMPs系列蛋白的改进方向[16]。

稻瘟菌作为重要的植物病原菌严重影响了水稻生产，稻瘟菌中钙离子相关基因影响菌株发育和致病力已有报道，但是稻瘟菌在侵染过程中其细胞质中钙离子动态变化仍不清楚。因此本研究通过构建钙离子响应蛋白GCaMP6s稻瘟菌异源表达菌株，将钙信号可视化，为进一步研究稻瘟菌在生长发育和侵染过程中细胞质中钙离子变化，侵染机制和防治方法提供研究材料。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及试剂

稻瘟菌YN153和YN157、大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株、稻瘟菌表达载体pYF11、酵母菌株EGY48均由本实验室保存，稻瘟菌的培养、保存及基因组提取参照Talbot等的方法[17]。Taq酶、高保真酶购于南京诺唯赞生物技术有限公司;限制性内切酶Xho Ⅰ购于TaKaRa公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和大肠杆菌质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;酵母质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;细胞壁裂解酶购自Sigma-Aldrich公司;博来霉素购自Solarbio公司。YEPD液体培养基（20 g葡萄糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，定容至1 L）用于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的培养;液体CM培养基（3 g酸水解酪蛋白，3 g酶水解干酪素，6 g酵母粉，10 g蔗糖，定容至1 L）用于真菌菌丝生长;TB3培养基（3 g酵母粉，3 g酸水解干酪素，20%蔗糖，0.7%低熔点琼脂糖，定容至1 L）用于原生质体的再生培养;色氨酸缺陷型培养基（山梨醇182.2 g，不含氨基酸的基础培养基6.7 g，缺失色氨酸的培养基0.74 g，葡萄糖20 g，定容至1 L）用于酵母转化子的筛选。试验所用引物由笔者设计（表1），引物的合成均由昆明擎科生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 GCaMP6s基因的克隆

以质粒pGP-CMV-GCaMP6s为模板，使用高保真核酸聚合酶和引物对GCaMP6s-F/GCaMP6s-R（表1）对GCaMP6s编码区扩增，扩增片段长度为1 356 bp。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对片段大小正确的条带切胶回收纯化。

1.2.2 RP27pro∶GCaMP6s表达载体的构建

本研究利用稻瘟菌中启动27号核糖体蛋白基因表达的启动子RP27作为GCaMP6s在稻瘟菌中表达的启动子。使用限制性内切酶XhoⅠ处理穿梭质粒pYF11成线性化载体，将经胶回收纯化的目的片段和pYF11共转化到色氨酸合成缺失的酵母菌株EGY48感受态细胞中，并将其均匀涂在色氨酸缺陷型培养基上，倒置于恒温培养箱中30℃培养3 d，挑取单菌落，加到5 mL YEPD液体培养基中30℃ 120 r/min振荡培养2 d，使用酵母质粒提取试剂盒提取质粒RP27pro∶GCaMP6s。将提取的质粒RP27pro∶GCaMP6s转化到E.coli DH5α感受态细胞中，并将其均匀涂布在含有50 μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB平板上，置于恒温培养箱37℃培养过夜。以引物對pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R（表1）对挑取的单菌落进行PCR验证，扩增片段长度为2 145 bp，挑取5个阳性菌株送昆明擎科生物技术有限公司测序。通过DNAMAN软件分析测序结果，验证正确后，提取质粒备用。

1.2.3 PEG介导的稻瘟菌原生质体转化

PEG介导的稻瘟菌原生质体转化方法参照文献[18]。

将燕麦固体培养基上的稻瘟菌YN153和YN157切成小块，置于液体CM培养基中，28℃ 150 r/min培养3 d;过滤收集菌丝后转移至细胞裂解酶溶液中，28℃ 80 r/min裂解2～3 h，镜检原生质体裂解情况，10倍镜下原生质体的数量达到1×106个可进行后续试验。用1×STC溶液重悬原生质体，并将浓度调整为1×108个/mL。将200 μL原生质体与30 μL质粒混合，28℃黑暗孵育20 min，加入1.5 mL含有40% PEG的STC溶液，共同孵育20 min后加入TB3液体培养基，28℃ 80 r/min过夜复苏12 h。将复苏后的菌株涂布于含有150 μg/mL博来霉素的TB3固体培养基中培养。

1.2.4 重组表达菌株的筛选gzslib202204041218

在复苏后第5天，挑取在含150 μg/mL博来霉素的TB3培养基上能够正常生长的单菌落转移至含有博来霉素的PDA上扩大培养，提取菌丝DNA，以引物对GCaMP6s-F/GCaMP6s-R进行PCR验证，阳性菌株转化子送昆明擎科生物技术有限公司测序。使用DNAMAN软件对测序结果进行分析，验证正确后将菌株保存备用。

1.2.5 重组表达菌株的荧光观察

挑取鉴定成功的转化子菌丝分别加到含有20 μL超纯水和0.01 g/mL CaCl2溶液的载玻片上，在0 h和2 h分别通过荧光显微镜观察GCaMP6s基因在重组表达菌株中的表达情况。对绿色荧光较强的转化子进行单孢培养，将荧光蛋白稳定表达的转化子用灭菌纸片干燥保存。

1.2.6 重组表达菌株的表型观察

1.2.6.1 重组表达菌株的菌落形态观察

将野生型菌株及筛选成功的转化子分别接种到PDA平板上，28℃黑暗培养，7 d后观察测量野生型和重组表达菌株菌落形态和大小。每个菌株分别接种3个PDA平板，试验重复3次。

1.2.6.2 重组表达菌株分生孢子的产孢量测定

使用燕麦培养基作为产孢培养基，每个菌株分别接种3个平板，28℃黑暗培养4 d，光照培养10 d，向平板中加入5 mL无菌水将分生孢子洗下，在血球计数板上计数并统计产孢量，试验重复3次。

1.2.7 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 23中的student t 测验分析数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 RP27pro∶GCaMP6s表达载体的构建及PCR鉴定

使用引物对GCaMP6s-F/GCaMP6s-R以含有GCaMP6s（片段大小为1 356 bp）的质粒为模板，获得了用于连接pYF11载体的目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小正确（图1）。利用酵母重组将目的基因与pYF11连接并转入稻瘟菌YN153与YN157中。使用引物对pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R进行菌落PCR鉴定（条带大小为2 145 bp），阳性率达到89%（图2）。从PCR阳性菌株中随机挑选5个样品送到昆

明擎科生物技术有限公司测序，测序结果同目的片段一致，表明GCaMP6s正确连接到pYF11上（图3）。

2.2 重组表达菌株的遗传转化及筛选

提取转化的稻瘟菌株菌丝DNA后，使用引物对pYF11-NP-SEQ-F/GCaMP6s-R进行PCR鑒定（条带大小为2 145 bp），结果表明，8个菌株DNA中均扩增到GCaMP6s片段（图4）。

2.3 重组表达菌株的荧光观察

对转化并筛选成功的重组表达菌株YN153-RP27pro∶GCaMP6s和YN157-RP27pro∶GCaMP6s进行荧光显微镜观察，通过滴加0.01 g/mL CaCl2溶液和超纯水的对比处理，发现加0.01 g/mL CaCl2溶液的营养菌丝及孢子细胞中均能观察到较强的绿色荧光，连续培养3代后，其绿色荧光依然保持良好（图5），说明该基因已在稻瘟菌中稳定表达，并且参与了稻瘟菌对钙离子的响应。

2.4 重组表达菌株的生长及产孢量的测定

为了进一步分析GCaMP6s基因的转入是否影响稻瘟菌营养生长及产孢，将两个野生型菌株和两个重组表达菌株分别接种于PDA培养基以及燕麦培养基，培养7 d后在PDA培养基上测量菌落直径并拍照;培养14 d后计数燕麦培养基上的产孢量，发现重组表达菌株与野生型菌株的菌丝生长和产孢量均没有显著差异（图6），结果表明GCaMP6s基因的转入不影响稻瘟菌的菌丝生长和产孢。

3 讨论

由于钙离子在细胞生命活动过程中发挥重要作用，因此钙离子细胞成像已成为现代生物学的前沿课题。细胞游离钙的检测方法主要有钙离子选择性微电极法、同位素示踪法、核磁共振法、荧光指示剂法等。其中，钙离子选择性微电极法反应速度较慢，可能会损害质膜引起渗漏;同位素示踪法对静息状态Ca2+不敏感，试剂有一定的放射性;核磁共振法成本太高，不能普遍适用[19]。而荧光指示剂法有很多优点：比如荧光探针易导入细胞，对细胞无损伤;反应速度快;能与其他多种先进技术联合应用等[20]。较早用于钙离子成像的是一种单分子荧光指示剂fura-2和Oregon Green BAPTA-1，但是这种染料对成像背景要求高，为了避免背景因素的干扰，只能对单个细胞进行染色观察[21]。

钙离子指示蛋白GCaMP6s作为一种人工合成蛋白对细胞内钙离子浓度变化敏感，并将钙信号可视化，极大地推动了钙离子信号传导研究，并在动物、植物和微生物中大量应用。稻瘟菌中钙离子信号通路的研究主要涉及菌株生长发育和致病性，但是在钙离子可视化方面未见报道。由于GCaMP6s属于外源基因，选用合适的启动子对于基因的异源表达十分重要，植物基因工程中应用的异源组成型启动子主要有CaMV 35S启动子，它是花椰菜花叶病毒侵染时启动35S RNA合成基因的启动子，在基因功能研究中应用广泛;常用的还有来自农杆菌的Nos和Ocs启动子。在丝状真菌中，3-磷酸甘油脱氢酶编码的基因gpdA在构巢曲霉Aspergillus nidulans中能够驱动异源基因的转录;里氏木霉Trichoderma reesei pki1是编码丙酮酸激酶组成型表达的基因，常用于表达一些筛选标记基因和报告基因[22];RP27启动子属于稻瘟菌中核糖体蛋白家族基因的启动子，具有启动能力强，表达稳定的特点，因此本研究选用具有RP27启动子的pYF11载体进行研究，并成功构建了YN153-RP27pro∶GCaMP6s和YN157-RP27pro∶GCaMP6s异源表达菌株，荧光显微镜观察表明，GCaMP6s基因接收到钙离子信号后，能够在菌丝和分生孢子中稳定表达，而且不影响菌株的生物学特性。本研究可为后续稻瘟菌细胞质中钙离子浓度变化与菌株生长发育和侵染之间关系的研究提供材料。gzslib202204041218

参考文献

[1] 郑远， 陈兆进. 植物细胞器钙信号研究进展[J]. 植物生理学报， 2015， 51（8）： 11951203.

[2] PARK H S， LEE S C， CARDENAS M E， et al. Calcium-calmodulin-calcineurin signaling： a globally conserved virulence cascade in eukaryotic microbial pathogens [J]. Cell Host & Microbe， 2019， 26（4）： 453462.

[3] TSAI H C， CHUNG K R. Calcineurin phosphatase and phospholipase C are required for developmental and pathological functions in the citrus fungal pathogen Alternaria alternata [J]. Microbiology， 2014， 160（7）： 14531465.

[4] XIONG Dianguang， WANG Yonglin， TANG Chen， et al. VdCrz1 is involved in microsclerotia formation and required for full virulence in Verticillium dahliae [J]. Fungal Genetics and Biology， 2015， 82： 201212.

[5] PEREZ M J， CASTILLO L S， SGARLATA C， et al. Pathocycles： Ustilago maydis as a model to study the relationships between cell cycle and virulence in pathogenic fungi [J]. Molecular Genetics and Genomics， 2006， 276（3）： 211229.

[6] BUTLER M J， GARDINER R B， DAY A W. Melanin synthesis by Sclerotinia sclerotiorum [J]. Mycologia， 2009， 101（3）： 296304.

[7] SCHUMACHER J， DE L I F， TUDZYNSKI B. Calcineurin-responsive zinc finger transcription factor CRZ1 of Botrytis cinerea is required for growth， development， and full virulence on bean plants [J]. Eukaryotic Cell， 2008， 7（4）： 584601.

[8] CHOI J， KIM Y， KIM S， et al. MoCRZ1， a gene encoding a calcineurin-responsive transcription factor， regulates fungal growth and pathogenicity of Magnaporthe oryzae [J]. Fungal Genetics and Biology， 2009， 46（3）： 243254.

[9] 张岳平. 反向遗传学及在稻瘟菌和镰孢菌功能基因研究中的应用[J]. 湖南农业科学， 2011（3）： 14.

[10]张弘. 稻瘟菌酸性pH响应基因的鉴定和生物学功能分析[D]. 武汉： 华中农业大学， 2018.

[11]LIU Xiaohong， LU Jianping， DONG Bo， et al. Disruption of MoCMK1， encoding a putative calcium/calmodulin-dependent kinase， in Magnaporthe oryzae [J]. Microbiological Research， 2010， 165（5）： 402410.

[12]HE Ronglin， FAN Ronghui， LIN Fuchen， et al. Functional analysis of MoCMKK2 gene in Magnaporthe oryzae [J]. 细胞生物学杂志， 2009， 31（4）： 521527.

[13]KOTLIKOFF M I. Genetically encoded Ca2+ indicators： using genetics and molecular design to understand complex physiology [J]. Journal of Cellular Physiology， 2007， 578： 5567.

[14]NAKAI J， OHKURA M， IMOTO K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein [J]. Nature Biotechnology， 2001， 19（2）： 137141.

[15]CHEN Tsaiwen， WARDILL T J， SUN Yi， et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity [J]. Nature， 2013， 499（7458）： 295300.

[16]YANG Yaxiong， LIU Nan， HE Yuanyuan， et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP [J/OL]. Nature Communications， 2018， 9（1）： 1504. DOI： 10.1038/s41467018037196.

[17]TALBOT N J， EBBOLE D J， HAMER J E. Identification and characterization of MPG1， a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea [J]. The Plant Cell， 1993， 5（11）： 15751590.

[18]王越， 李雅凝， 曲曉磊， 等. 丝状真菌遗传转化体系及筛选技术的研究进展[J]. 中国林副特产， 2020（6）： 6975.

[19]胡振妍， 赵晓玉， 王浩然， 等. 植物细胞钙离子检测与成像技术研究进展[J]. 电子显微学报， 2016， 35（2）： 171179.

[20]高迪， 张丹丹. 细胞内钙离子检测技术[J]. 科技信息， 2009（29）： 43.

[21]姚洁， 孙津歌， 史乐谦， 等. 细胞内自由钙离子的测定—荧光指示剂法[J]. 资源节约与环保， 2019（7）： 136137.

[22]MACH R L， SCHINDLER M， KVBICEK C P. Transformation of Trichoderma reesei based on hygromycin B resistance using homologous expression signals[J]. Current Genetics， 1994， 25（6）： 567570.