姜洞彬 李梁和 程海玉 徐 伟 张建栋 陈忠胜 杨 勤 詹 玮

(1 贵州医科大学外科学教研室，贵阳市 550004，电子邮箱:jiangjdb@qq.com；2 贵州医科大学附属肿瘤医院胃肠外科，贵阳市 550000；3 贵州医科大学附属医院肛肠外科，贵阳市 550004;4 贵州医科大学病理生理学教研室，贵阳市 550004)

2020年全球最新癌症统计数据显示，约有1 930万新发病例和1 000万死亡病例，且预计有增加的趋势，其中肝癌作为生存率较低的恶性肿瘤，在全球前10位癌症中新发病例(占4.7%)及死亡病例(占8.3%)分别位于第6位及第3位；我国作为肝病大国，在所有癌症中肝癌新发病例(占9%)及死亡病例(占13%)分别位于第5位及第2位[1]。目前，肝癌的发病机制尚不明确且治疗效果欠佳，探讨其发病机制和防治手段成为众多学者研究的重点。已有研究表明，肝癌的发病机制可能与组蛋白乙酰化修饰水平异常密切相关，但对乙酰化位点修饰的具体研究却少之又少[2]。

蓝莓花青素是一类天然营养素，具有抗炎、抗肿瘤等功效，但其防治肿瘤的具体机制不详。近年来，表观遗传学的兴起为研究癌症的发病机制提供了新思路，从分子水平探讨其发病机制成为热门话题。因此，或许可从表观遗传学角度出发，探讨蓝莓花青素对肝癌细胞增殖的抑制作用。本研究通过实时无标记动态细胞分析技术(Real Time Cellular Analysis，RTCA)、免疫荧光法、蛋白免疫印迹法，从表观遗传学角度探讨不同浓度蓝莓花青素对高侵袭性人肝癌LM3细胞增殖的抑制作用以及对细胞组蛋白(包括H3K14、H3K18、H3K27)乙酰化修饰的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肝癌LM3细胞株、蓝莓花青素为实验室冻存；杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)购于上海语纯生物科技有限公司(批号：YC-2049)；青霉素-链霉素(批号：2321134)、谷氨酰胺(批号：21051024)、胎牛血清(批号：2139378CP)、胰蛋白酶/EDTA溶液(批号：2192619)、彩虹Marker(批号：20616)均由Thermo Fisher Scientific公司提供；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号：D253071)、细胞裂解液(批号：P0013)、二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(批号：P0012S)均购自上海碧云天生物技术有限公司；锥虫蓝(批号：QT6229)购于华美生物工程公司；抗H3抗体、抗乙酰化H3K14(acetylated H3K14,acH3K14)抗体、抗乙酰化H3K18(acetylated H3K18,acH3K18)抗体、抗乙酰化H3K27(acetylated H3K27,acH3K27)抗体、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)均购自Abcam公司(批号：ab1791、ab52946、ab40888、ab4729、ab150077)。

1.2 实验仪器 倒置生物显微镜(型号：EVOS XL Core细胞成像系统)由Thermo Fisher Scientific公司提供；倒置荧光显微镜(型号：BZ-X800E)由基恩士(中国)有限公司提供；CENCE湘仪离心机(型号：TDZ5-WS)由苏州雨泽仪器有限公司提供；xCELLigence RTCA仪、E-Plate 16检测板由艾森生物(杭州)有限公司提供；ChemiDoc Touch化学发光成像系统由武汉世纪珞珈科有限公司提供；Image J图像处理软件由National Institutes of Health开发。

1.3 实验方法

1.3.1 LM3细胞的培养：采用含10%胎牛血清及1%链霉素-青霉素的DMEM培养基培养LM3细胞，放置于5% CO2、37℃培养箱内培养，定期更换培养液，进行传代培养，每周测一次pH值，调整pH维持在7.0左右；每两周于培养液中加入谷氨酰胺(每100 mL培养液中加入2 mL谷氨酰胺，调整终浓度为4 mmol/L)，取呈对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2 干预方法：于6 cm的培养皿中铺1×105个细胞进行传代培养，置于5% CO2、37℃培养箱培养20 h后，取出培养皿，观察培养皿颜色、清澈度等，须保证无污染等情况，倒出培养液并用平衡盐溶液冲洗3次，向各培养皿中分别加入配置好的5种不同浓度(0、50、100、150、200 μg/mL)的蓝莓花青素1 mL，其中以0 μg/mL为对照组。

1.3.3 LM3细胞生长形态的观察：取1.3.2中不同浓度蓝莓花青素干预的LM3细胞继续置于5% CO2、37℃培养箱培养30 h后，显微镜下观察细胞生长情况。弃培养液，培养皿中加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，静置1～2 min后终止消化，平衡盐溶液冲洗掉消化液并制备细胞悬液，取悬液0.5 mL并加入0.3%锥虫蓝染液0.5 mL，3～5 min后滴入细胞计数板上，生物显微镜下计数4大格内细胞数量，细胞数(个/mL)=4个大格细胞总数/4×稀释倍数×104，实验重复3次。

1.3.4 免疫荧光法观察细胞凋亡现象：取1.3.2中不同浓度蓝莓花青素干预的LM3细胞置于5% CO2、37℃培养箱培养30 h后的培养皿，将培养液移至离心管中，平衡盐溶液洗涤贴壁细胞1次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸溶液1 mL，室温孵育1～2 min，吸除消化液，避免胰酶过度消化；用离心管中的培养液将细胞吹打下来，移至离心管，置于离心机中2 000 r/min离心5 min，弃上清并收集细胞，平衡盐溶液洗涤2次，重复前面离心步骤，弃上清并收集细胞，利用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。细胞中加入195 μL结合缓冲液悬浮细胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，轻轻混匀，室温避光摇床孵育20 min，涂片后于倒置荧光显微镜下观察不同浓度蓝莓花青素处理后细胞的凋亡情况。Annexin V-FITC可使早期凋亡细胞绿染，PI能够透过细胞膜使细胞核染红，红染增多说明中晚期的凋亡细胞增多。重复实验3次。

1.3.5 RTCA法检测细胞增殖情况：向E-Plate检测板中加入150 μL DMEM培养液并测定基线(未加入细胞时的阻抗值)，保证每个实验孔的细胞指数(cell index,CI)低于0.063。取对数生长期的LM3细胞制备细胞悬液并计数(细胞密度为5×104个/mL)，取出E-Plate检测板，加入适量体积的细胞，确保各孔道细胞数目为5 000个/100 μL。E-Plate检测板在室温超净台内放置30 min后，放入RTCA 工作台上进行实时动态的细胞生长、增殖、贴壁检测。过夜检测(共19 h)后，参照相关文献[3]的药物浓度设置，在各培养孔中分别加入配置好的5种不同浓度(0、50、100、150、200 μg/mL)的蓝莓花青素100 μL并继续进行实时动态检测，每间隔15 min利用RTCA系统检测一次，检测至蓝莓花青素干预34 h。基于测量到的电极阻抗值自动获取相应的CI，即用CI表示贴壁细胞引起的阻抗值，CI=(n时间点阻抗值-不存在细胞时阻抗值)/标称阻抗值(标称阻抗值是指xCELLigence RTCA仪器上标注的阻抗值)。实验重复3次。实时动态检测各时间点蓝莓花青素干预LM3细胞后的增殖状况，进而分析出蓝莓花青素处理LM3细胞的最适浓度和时间。

1.3.6 蛋白免疫印迹法检测LM3细胞中组蛋白乙酰化位点修饰水平：按1.3.2的步骤使用0 μg/mL、100 μg/mL蓝莓花青素干预LM3细胞。干预34 h后收集细胞，分别加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min后，4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清弃沉淀，按照二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒使用说明书的操作步骤进行蛋白定量检测。蛋白定量后，制胶并加入内槽液、外槽液，取40 μg总蛋白上样，中间加入Marker 10 μL，通电80 V 2 h，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭，室温下摇床2 h，倒掉封闭液，加TBST盖过膜，摇床7 min/次，分别加入抗acH3K14抗体(1 ∶1 000)、抗acH3K18抗体(1 ∶1 000)、抗acH3K27抗体(1 ∶1 000)、抗H3抗体(1 ∶400)，4℃低温过夜，TBST洗膜3次(7 min/次)，加入按1 ∶1 000稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)，摇床处理1 h，TBST洗膜3次(7 min/次)，采用化学发光法显色，成像系统曝光拍照。实验重复3次。以H3为内参照，用Image J图像处理软件检测所得条带灰度值并进行含量分析。

1.4 统计学分析 使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度蓝莓花青素处理后LM3细胞的形态变化 没有加入蓝莓花青素(0 μg/mL)的LM3细胞生长旺盛；经过蓝莓花青素干预后的细胞体积缩小，细胞数目减少，且随蓝莓花青素浓度升高，LM3细胞形态改变更加明显，即LM3细胞体积更小，数目越少。见图1。与0 μg/mL蓝莓花青素干预的LM3细胞相比，50、100、150、200 μg/mL蓝莓花青素干预后的LM3细胞数减少(均P<0.05)，其中100 μg/mL及以上浓度蓝莓花青素处理后细胞数减少50%及以上。见表1。

表1 不同浓度蓝莓花青素干预后LM3细胞数(x±s，×106个/mL)

图1 不同浓度蓝莓花青素处理后LM3细胞的形态(×200)

2.2 不同浓度蓝莓花青素处理后LM3细胞凋亡情况 随着蓝莓花青素浓度的增高，中晚期LM3细胞凋亡数目逐渐增多。见图2。

图2 不同浓度蓝莓花青素处理LM3细胞的凋亡情况(×200)

2.3 不同浓度蓝莓花青素处理后LM3细胞增殖情况 与0 μg/mL蓝莓花青素相比，除干预12 h时的50 μg/mL蓝莓花青素外，各时间点不同浓度蓝莓花青素干预后LM3细胞的增殖水平均减弱(均P<0.05)，且具有剂量依赖性(均P<0.05)。在干预34 h时，100 μg/mL蓝莓花青素对LM3细胞的增殖抑制率超过50%，150 μg/mL、200 μg/mL蓝莓花青素的抑制率明显大于50%，故可选取100 μg/mL蓝莓花青素干预34 h作为处理LM3细胞的最适浓度和时间进行后续实验。见表2和图3。

表2 不同浓度蓝莓花青素干预LM3细胞后的增殖情况(x±s，CI值)

图3 不同浓度蓝莓花青素处理LM3细胞的增殖时-效曲线

2.4 最适浓度蓝莓花青素对LM3细胞组蛋白乙酰化的影响 与0 μg/mL蓝莓花青素相比，100 μg/mL蓝莓花青素干预34 h后LM3细胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相对表达水平均增加(均P<0.05)。见表3和图4。

表3 0、100 μg/mL蓝莓花青素干预34 h后LM3细胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的相对表达水平(x±s)

图4 0、100 μg/mL蓝莓花青素干预34 h后LM3细胞中acH3K14、acH3K18、acH3K27的表达情况

3 讨 论

近年来，天然植物营养素防治肿瘤的作用引起了众多学者的关注。蓝莓是当前广受欢迎的水果之一，其富含类黄酮(主要成分为花青素)，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[4]。有研究表明，蓝莓花青素可显著减少肝纤维化中脂质过氧化和氧化损伤的产物，缓解肝纤维化[5]；蓝莓可通过锦葵色素-3-半乳糖苷在体内、外途径抑制肝癌细胞的增殖[6]。但缺乏蓝莓花青素对高侵袭性肝癌细胞的影响的相关研究。故本研究选择高侵袭性人肝癌LM3细胞作为研究对象，评估蓝莓花青素对该细胞增殖的抑制作用。结果显示，经50、100、150、200 μg/mL蓝莓花青素干预后，高侵袭性人肝癌LM3细胞的数量减少，中晚期凋亡细胞增多，增殖活性减弱，且随着干预浓度增加，上述现象更为显著，提示一定浓度的蓝莓花青素可剂量依赖性地通过抑制增殖活性、诱导凋亡来控制高侵袭性肝癌细胞的生长，这与其对胃腺癌BGC-823细胞增殖的抑制作用[7]相符。

组蛋白修饰是在相关酶作用下N末端赖氨酸残基侧链被乙酰基取代的过程，多发生在H3上的14、18、27等位点，这些位点可激活或沉默基因[8-9]。组蛋白修饰是表观遗传学修饰中的一种，指不改变DNA序列而产生可遗传的表型变化，进而导致癌症的发生和发展[10]。例如，Guo等[11]发现，上调乳腺癌细胞组蛋白乙酰化修饰水平可以延缓乳腺癌的进展。肝癌的发生和发展机制研究已进入分子水平阶段，其已被证实是一种基因组疾病，但具体发病机制尚未明确[12]。而有研究表明，在肝癌发生过程中存在多种表观遗传变异[13]。Niu等[14]发现，人肝癌细胞中的H3组蛋白乙酰化修饰水平明显降低。但目前有关表观遗传学中组蛋白乙酰化修饰水平与肝癌关系的相关研究仍较少。有学者指出天然营养素的抗癌作用与癌细胞中组蛋白的翻译后修饰水平有关，其中包括肝癌、宫颈癌、胃癌等癌细胞[15-17]。本课题组的前期动物实验结果也提示，蓝莓中的营养成分可改善肝纤维化大鼠肝功能，这可能与其提高大鼠肝组织组蛋白乙酰化修饰水平有关[18]。故本研究通过体外实验，进一步探讨蓝莓花青素抑制人肝癌LM3细胞增殖的作用机制。结合当前国内外研究现状，本研究选取组蛋白H3K14、H3K18、H3K27位点进行分析。蛋白免疫印迹结果显示，100 μg/mL蓝莓花青素干预34 h后LM3细胞的acH3K14、acH3K18、acH3K27相对表达水平均增加(均P<0.05)。在抗肿瘤药物中，组蛋白修饰已成为热门靶点，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)在干预癌症中发挥重要作用，其通过提高组蛋白乙酰化水平促进基因转录，从而达到预防和治疗疾病的目的[19-20]，已被美国食品药品监督管理局批准应用于肿瘤治疗。由此我们推测，蓝莓花青素抑制高侵袭性人肝癌LM3细胞的作用机制与HDACI类似，即可抑制组蛋白去乙酰作用，上调癌细胞相关位点组蛋白乙酰化修饰水平[21]，进而抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡。

综上所述，蓝莓花青素可剂量依赖性地抑制高侵袭性人肝癌LM3细胞的增殖，促进其凋亡，这可能与其提高细胞组蛋白H3K14、H3K18、H3K27乙酰化修饰水平有关。蓝莓花青素或可成为具有巨大潜力的HDACI，为肝癌的综合治疗模式提供新思路，但尚需深入研究阐明具体机制。本实验仅初步研究了蓝莓花青素上调细胞部分组蛋白乙酰化修饰位点的情况，而细胞凋亡是一个复杂的程序性死亡[22]，组蛋白相关位点乙酰化水平升高与细胞凋亡的内在联系仍有待进一步研究。