袁长深 官岩兵 容伟明 李 哲 梅其杰 延伟伟 段 戡

(1 广西中医药大学第一附属医院骨三科，南宁市 530023，电子邮箱：yuanchangshen0920@126.com；2 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530000)

骨关节炎是一种常见且难以逆转的慢性退行性疾病，可导致患者疼痛、行走不便甚至残疾，严重影响患者的生活质量。在全球范围内，其发病率已达15%，且与日俱增，预计未来10年这一比例将上升为35%[1]。糖尿病是一种较为普遍的慢性疾病，其长期存在的胰岛β细胞功能异常是胰腺癌发生的重要诱因，并给患者本身及社会带来了巨大经济负担。全世界范围内，已有4亿以上的人口受糖尿病困扰，且人数逐年递增，预估到2040年将高达6.5亿[2]。近年来，骨关节炎与糖尿病合并发病的情况较为多见。流行病学研究显示，糖尿病患者中骨关节炎的患病率和骨关节炎患者中糖尿病的患病率分别为29.5%和14.4%，糖尿病患者的骨关节炎总体风险为1.46，骨关节炎患者的糖尿病总体风险也达1.41[3]。不少研究人员表示两者之间关系密切，甚至提出了糖尿病性骨关节炎的概念[4-6]。然而，也有部分学者对此持否认态度，认为二者并不存有相关性[7]。因此，明确两者的潜在联系，对骨关节炎及糖尿病的防治具有重要意义。

生物信息学是一门基于电子信息技术对生物医药领域进行相关研究的交叉性学科，可从基因分子的角度寻找疾病之间的潜在规律。因此，本研究基于生物信息学对骨关节炎与糖尿病的共同疾病基因及相关微小RNA(microRNA,miRNA)进行筛选鉴定与分析，为防治二者合并发病、减少糖尿病性骨关节炎患者提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 疾病相关基因的筛选 在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中分别以“osteoarthritis”“diabetes mellitus”为检索词，筛选出与骨关节炎相关的基因芯片数据集GSE55235及糖尿病相关的基因芯片数据集GSE29221。然后，通过GEO2R在线分析系统(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，对GSE55235中的10例对照组与10例骨关节炎组、GSE29221中的12例对照组与12例糖尿病组进行基因差异表达分析，并下载系统生成的后缀名为“csv”格式文件，将后缀名改为“xls”格式，以Excel表格形式打开并删除重复项与空缺值，最后再以同时满足P≤0.05和|log2FC|≥1为筛选条件，筛选出骨关节炎及糖尿病的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。

1.2 筛选共同疾病基因 通过R软件包“VennDiagram”对骨关节炎及糖尿病相关DGE进行分析并取交集，建立韦恩图，以获得共同疾病基因。

1.3 共同疾病基因的富集分析 将得到的共同疾病基因输入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，保存结果并进行可视化输出。

1.4 PPI网络的创建及关键基因的筛选 在STRING(https://string-db.org/)数据库中，以综合评分≥0.4为限制条件，创建共同疾病基因的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,然后进行网络拓扑分析，并采用Cytoscape软件所附带的“cytoHubba”插件中的Closeness、Degree、Bottleneck及MNC等4种不同计算方法分别挖掘出得分最高的前10位基因，取交集后获得Hub基因。

1.5 Hub基因相关miRNA的预测 将Hub基因依次导入miRNet(https://www.mirnet.ca/)数据库内获得Hub基因相关miRNA，然后可视化呈现Hub基因及相关miRNA的网络调控关系，并筛选出与4个Hub基因的相关性程度综合排名位列前5的关键miRNA。

2 结 果

2.1 骨关节炎和糖尿病的共同疾病基因 对骨关节炎基因芯片GSE55235及糖尿病基因芯片GSE29221进行分析，得到骨关节炎相关DEG共1443个(上调基因525个，下调基因920个)，糖尿病相关DEG共1 176个(上调基因919个，下调基因257个)，见图1。利用R语言软件包“VennDiagram”将获得的二者相关DEG取交集，共获得148个共同疾病基因，见图2。

图1 骨关节炎和糖尿病相关DGE的筛选结果

图2 Venn图

2.2 GO和KEGG富集分析结果 通过DAVID数据库对共同疾病基因进行GO和KEGG富集分析，发现其在GO富集分析的生物过程模块中主要富集在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的细胞反应、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组织、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)刺激的细胞反应等;在细胞成分模块中主要富集在ECM、胶原三聚体、蛋白细胞外基质等；在分子功能模块中主要富集在肝素结合、血小板衍生生长因子结合、蛋白质同源二聚活性等。在KEGG富集分析中发现其主要富集在磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信号通路中。见图3及图4。

图3 GO富集分析结果

图4 KEGG富集分析结果

2.3 PPI网络构建及关键基因筛选结果 采用STRING数据库建立共同疾病基因的PPI网络后，通过网络拓扑分析并利用4种不同计算方法分别筛选出得分前10位的基因，进行交集后得到4个Hub基因：CD44、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)、C-C基序趋化因子配体5(C-C motif chemokine ligand 5,CCL5)及Ⅰ型胶原α2链(collagen type Ⅰ alpha 2 chain，COL1A2)。见表1和图5。

表1 4个Hub基因在4种不同算法的得分(分)

图5 4种算法筛选得到基因的交集图

2.4 4个Hub基因相关miRNA的预测 通过miRNet数据库预测4个Hub基因的相关miRNA，共发现359个有关的miRNA，筛选出综合排名位列前5的关键miRNA，分别为miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p，见表2及图6。

表2 5个关键miRNA的信息

图6 Hub基因与上游miRNA的网络调控图

3 讨 论

临床上骨关节炎与糖尿病合并发病并不少见，但二者的相关性仍存有争议[8]。因此，本研究从生物分子学层面挖掘出骨关节炎与糖尿病的共同发病基因及其相关miRNA，以明确二者的潜在联系，从而预防糖尿病性骨关节炎。

本研究通过GEO数据库及GEO2R的在线分析工具共得到148个可同时存在于骨关节炎与糖尿病中的共同疾病基因，经GO及KEGG富集分析发现这些共同疾病基因主要富集在TNF、ECM、FGF等相关生物功能及PI3K/Akt与MAPK等信号通路中。(1)TNF与骨关节炎、糖尿病的关系：TNF-α作为TNF家族中重要组成部分，可间接参与骨关节炎的调控，其介导的白细胞介素34表达水平与膝骨关节炎滑膜炎的严重程度呈正相关[9]；而在1型糖尿病中，高表达状态的TNF-α往往预示着血糖的控制情况并不理想[10]。(2)ECM与骨关节炎、糖尿病的关系：对2型糖尿病而言，脂肪细胞代谢障碍是其发病的重要诱因，而ECM又是损害脂肪细胞部分代谢功能的关键因素[11]；对骨关节炎而言，ECM合成与降解的失衡状态可造成关节软骨的破坏，并可作为判断其发生的重要标志[12]。(3)FGF与骨关节炎、糖尿病的关系：FGF的不同亚族在骨关节炎及糖尿病中可发挥不同的调控作用。例如，在骨关节炎中，FGF18可增加胶原Ⅱ的沉积并抑制基质金属蛋白酶13的表达而减轻软骨的降解[13]；在糖尿病中，FGF21可降低血糖及改善代谢状况，并能减轻各种相关并发症的损伤[14]。(4)PI3K/Akt、MAPK信号通路与骨关节炎、糖尿病的关系：抑制PI3K/Akt传导途径能有效改善骨关节炎中关节软骨的变性[15]，但会诱发胰岛素抵抗而引发2型糖尿病[16]。p38-MAPK通路作为MAPK通路的关键成员，抑制该通路可抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡和促炎细胞因子的表达[17]，同时可抑制活性氧的产生及炎性介质的释放，从而通过调节RAS系统来显著延缓糖尿病肾病的进展[18]。

本研究进一步对PPI网络通过拓扑分析，并利用4种不同计算方法分别筛选出得分前10位的基因，再进行交集获得4个Hub基因，即CD44、IGF1、CCL5及COL1A2。CD44不仅可以破坏软骨细胞与ECM的相互作用关系，在膝骨关节炎关节软骨中呈高表达水平[19]，而且还可以导致胰岛素抵抗，其表达水平在糖尿病患者的血浆中上调[20]。IGF1是维持软骨平衡状态的重要因素，有望成为骨关节炎的治疗靶点[21]；其还与糖尿病的患病风险呈U形关联，即较低或较高的IGF1水平能明显增加糖尿病的患病概率[22]。CCL5不仅可以诱导多种基质金属蛋白酶及一氧化氮合酶的表达，从而引起骨关节炎中软骨ECM的降解[23]，而且还是1型糖尿病等免疫相关性疾病发病的重要因素,同时其表达水平的上调可能是1型糖尿病及其相关并发症发生的预测指标[24]。由此可见，CD44、IGF1及CCL5在骨关节炎及糖尿病中的重要调控作用，但目前尚未见有研究报告COL1A2同时在二者中发挥作用。

最后，通过对4个Hub基因进行相关miRNA预测，获得排名前5的miRNA：miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p。查阅相关文献后发现，miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p与miRNA-34a-5p在骨关节炎中分别起着不同的调控作用；然而在糖尿病中，却尚未发现上述miRNA能直接参与血糖的调控机制，但在糖尿病肾病中却扮演着重要的角色。(1)miRNA-26a-5p：促进miRNA-26a-5p的表达会抑制阳离子转运蛋白样蛋白1/核因子κB通路，以防止肾小管上皮细胞的炎症反应并延缓糖尿病肾病的发展[25]；在骨关节炎中，来源于人骨间充质干细胞的外泌体中的miRNA-26a-5p过表达会下调前列腺素内过氧化物合酶2的表达，延缓骨关节炎的进展[26]。(2)miRNA-27a-3p：研究表明，FOXD2-AS1的过表达会诱导骨关节炎软骨细胞发生炎症反应及软骨ECM出现降解，但miRNA-27a-3p可以逆转这一现象[27]；而在调控糖尿病肾病方面，miRNA-27a-3p则会引起肾纤维化、线粒体功能障碍和内质网应激反应来参与糖尿病肾病的发生[28]。(3)miRNA-98-5p：miRNA-98-5p不仅能通过靶向调控高迁移率族蛋白A2减轻上皮间质转化和肾纤维化进而延缓糖尿病肾病的进程[29]，而且其表达量的减少亦是导致骨关节炎软骨细胞凋亡的重要因素[30]。(4)miRNA-34a-5p：miRNA-34a-5p能抑制在肾间质纤维化演变中起重要作用的沉默信息调节因子1的表达，作为糖尿病肾病治疗的新靶点[31]；此外其在骨关节炎中呈高表达状态而破坏关节软骨稳态[32]。但是miRNA-29c-3p在骨关节炎及糖尿病中的调控作用，目前尚未见有相关研究报告。

综上所述，CD44、IGF1、CCL5及其对应的miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p同时在骨关节炎及糖尿病中发挥重要的调控作用。由此可见，骨关节炎和糖尿病之间存在潜在联系，这或可为今后防治糖尿病性骨关节炎提供一定的理论基础。但本研究方法也有不少不足之处，例如选取的基因芯片包含的样本数量不够大，以及只是单纯在理论层次上进行研究，而缺乏相关的体内外实验加以佐证等。