张秀停　赵洋民　王庆华　龚赛　姜淑霞

摘要：对板栗拟茎点霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae协同致病菌Ophiognomonia castanea的生物学特性进行了研究。结果表明，O.castanea菌丝在马铃薯一板栗叶培养基上生长最好，菌丝生长的适宜温度为15～28℃，最适温度为25℃，最适pH为6；最适宜碳源为甘露醇，氮源蛋白胨和牛肉浸膏能促进菌丝生长。

关键词：Ophiognomonia castanea；生物学特性；菌丝生长

中图分类号：S436.64 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0090-04

板栗褐缘叶枯病是近年来在山东板栗产区发生的一种新病害，其病原菌为板栗拟茎点霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae。在对板栗褐缘叶枯病的研究中发现，该病斑上还寄生一种Pphiognomonia属真菌Ophiognomonia castanea。目前，国内对Ophiognomonia属真菌的研究很少，对O.castanea的研究更未见报道。本试验对O.castanea的生物学特性进行了研究，并比较了与P.castaneae-mollissima生物学特性的差异，探讨两菌株的生长及致病关系，以期对板栗褐缘叶枯病的防治提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

发生板栗褐缘叶枯病的板栗叶片，采自山东省泰安市徂徕山林场光华寺林区。供试O.casta-nea菌株为病斑组织分离纯化的菌丝，经单菌丝萌发获得的纯菌落，保存于4℃冰箱中备用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同培养基对O.castallga菌丝生长的影响 选用PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL）、马铃薯一玉米粉培养基（马铃薯100g，玉米粉20g，琼脂20g，水1000mL）、马铃薯综合培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂20g，水1000mL）、玉米粉琼脂培养基（玉米粉50g，琼脂20g，水1000mL）、马铃薯-板栗叶培养基（马铃薯100g，板栗叶20g，葡萄糖20g，水1000mL）、板栗叶培养基（板栗叶20g，葡萄糖4g，玉米粉4g，琼脂16g，水1000mL）。在供试菌株的菌落边缘取直径5mm菌饼，移植到培养基平板中央，25℃恒温培养，于接种后的第4、7、10、14d用十字交叉法测量菌落直径。每处理重复5次。

1.2.2 不同碳源对O.castanea菌丝生长的影响 以PDA培养基为基础培养基，以2%葡萄糖为碳源，分别以相同含碳量的淀粉、蔗糖、甘油、甘露醇、麦芽糖、木糖、果糖替换葡萄糖，配制成含有不同碳源的培养基。其他方法同1.2.1。

1.2.3 不同氮源对O.castanea菌丝生长的影响 以PDA培养基为对照培养基，以3%硝酸钠为氮源，并以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化铵、尿素、天冬酰胺、牛肉膏、尿素，配制成含有不同氮源的培养基。其他方法同1.2.1。

1.2.4 不同温度对O.castallga菌丝生长的影响 在供试菌株的菌落边缘取直径5mm菌饼，移植到PDA培养基平板中央，分别置于5、15、20、25、28、30、35℃等7个不同温度梯度下培养。其他方法同1.2.1。

1.2.5 不同pH值对O.castanea菌丝生长的影响 将PDA培养基用灭菌的NaOH溶液和HCl溶液分别调pH值至3、4、5、6、7、8、9。其他方法同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对O.castanea菌丝生长的影响

试验结果（图1）表明，马铃薯一板栗叶、马铃薯一玉米粉、PDA、马铃薯综合、玉米粉琼脂和板栗叶培养基14d平均直径分别为3.43、2.85、2.41、1.64、1.62cm和1.44cm。马铃薯一板栗叶培养基长速显著快于其他培养基，菌丝生长旺盛，浓白，气生菌丝生长旺盛，但菌落略显薄，菌丝较稀疏；马铃薯一玉米粉培养基菌落较厚，菌丝粗壮，基生菌丝发达，气生菌丝不发达；PDA培养基菌落较厚，菌丝粗壮，气生菌丝生长旺盛；马铃薯综合、玉米琼脂和板栗叶培养基菌丝生长均较慢。

2.2 不同碳源对O.castanea菌丝生长的影响

在8种不同碳源的培养基上，以甘露醇为碳源的培养基上菌丝生长最好，生长快，菌落厚、致密，菌落边缘浓白，生长旺盛，中部淡黄色；麦芽糖培养基次之。在果糖、木糖培养基上，菌落较厚，菌丝生长旺盛，但菌落边缘不整齐，部分菌丝易老化变成淡黄色，菌丝短呈绒毛状，生长缓慢，部分菌落边沿呈黄棕色；在甘油、淀粉培养基上，菌落白色至淡黄色，略薄，老化现象明显；在葡萄糖、蔗糖培养基上，菌丝生长最差，菌丝老化严重，菌落均较小、薄，菌丝淡黄色短绒毛状，菌落边沿黄棕色（图2）。

2.3 不同氮源对O.castanea菌丝生长的影响

蛋白胨培养基上菌落生长速度快，菌落致密、厚，菌丝白色，生长旺盛，为最适氮源；牛肉浸膏次之。在硝酸钠培养基上，菌丝生长较快，菌落初期浓白致密，但后期气生菌丝徒长，菌丝细弱，菌落边沿薄；在对照、氯化铵、天冬酰胺和甘氨酸培养基上菌落较致密，菌丝白色至淡黄色，菌丝老化明显，菌落形状不规则。与对照相比，加入氮源蛋白胨、牛肉浸膏可以促进菌丝生长，而加入氮源氯化铵、天冬酰胺、硝酸钠、甘氨酸则抑制菌丝生长。以尿素为氮源的培养基中菌丝不生长。

2.4 不同温度对O.castanea菌丝生长的影响

菌丝在15～28℃的温度范围内都能生长，25℃时生长最快，且菌落最厚，菌丝浓密，生长旺盛。28℃以上生长缓慢，5℃和35℃时菌丝不能生长（图4），表明该菌适宜相对中温偏低的环境。

2.5 不同pH值对O.castanea菌丝生长的影响

菌丝在pH值5～8的PDA培养基中均能生长，以pH值6生长最好，菌落致密，生长速度最快，菌丝浓白。在pH值为5、7、8的培养基中，菌丝生长较快，菌落略薄，菌丝老化明显，菌落形状不规则。当pH值在3以下时，菌丝基本不能生长。pH值为9时，菌丝生长缓慢（图5）。

3 结论与讨论

对菌株O.castanea生物学特性研究结果表明，菌丝在马铃薯一板栗叶、马铃薯一玉米粉、PDA培养基上生长良好，以马铃薯一板栗叶培养基最为合适；适宜碳源为甘露醇和麦芽糖，以甘露醇为最佳；蛋白胨和牛肉浸膏能促进菌丝生长，促进作用最明显的是蛋白胨。菌丝生长的适宜温度为15～28℃，最适温度为25℃。菌丝在pH为4～9的PDA培养基中均能生长，最适pH为6。

自然条件下在夏末秋初O.castanea的菌丝出现在病斑上，此后发生量逐渐增多，直至11月，在这一时期气温相对适宜，有利于菌丝生长，这一现象与O.castanea菌丝适宜温度为15～28℃这一测定结果是一致的。在自然界只能在板栗褐缘叶枯病病斑扩展到一定大小时才能在其病健交界处分离到O.castanea，O.castanea和P.castaneae-mollissimae具有协同侵染的特性。姜淑霞等曾测出板栗褐缘叶枯病病原菌P.castaneae-mollis-simae的适宜温度范围为20～30℃，适宜pH范围为5～6。室内测定，适宜O.castanea菌丝生长的温度范围比P.castaneae-mollissimae的低，并且二者最适pH值相同，也证实了两菌在同一时间内共同生长在同一病斑上的自然现象。

在O.castanea菌丝的生物学特性试验中，不同处理条件下，培养时间延长后一些菌落会出现白色、黄色两种菌丝，白色菌丝生长较快，黄色菌丝生长缓慢，甚至不再生长，边沿黄棕色，两种菌丝生长速度不一，造成菌落形状不规则。分析认为，白色菌丝为正常菌丝，菌丝老化后产生淡黄色色素使菌丝发黄并且可以抑制菌丝的生长。