张同威，郑文杰，刘 岩，安立辉

（1.沈阳市第七人民医院皮肤科，沈阳 110003；2.中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001）

烫伤是指热液、热气引起的严重的皮肤损伤，形成烫伤创面，造成血管内皮细胞受损，大面积的烫伤会造成休克，引起组织缺血，造成器官损害甚至死亡[1-2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为特异性促血管内皮细胞生长的生物因子，在受损伤组织的细胞修复、细胞增殖中发挥重要作用[3]。血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）能与VEGF特异性结合，直接作用于血管及内皮细胞的生成，在血管生成及细胞增生中共同发挥重要作用，且在烫伤形成的创面组织中高表达，加速创面的愈合[4-6]。

原花青素作为一种常见的植物提取物，含有多种多酚类化合物，广泛存在于多种植物的果皮及种子中[7]。目前原花青素已经被证实具有多种有益活性，其自身特异性的化学结构使其具有很强的抗氧化能力，目前已被应用于多种疾病治疗，如心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化等[8]。最新研究发现，原花青素可以有效缓解血管细胞衰老，清除血管杂质，进而保护血管细胞，使血管恢复弹性，同时还可以消除水肿，改善血液循环[9-10]。原花青素B2 可显著改善糖尿病大鼠创面损伤，加速创面愈合，但其作用机理尚未明确[11]，推测原花青素对于烫伤形成的皮肤缺损同样具有良好的治疗效果，原花青素是否可应用于烫伤后的创面愈合治疗有待进一步探索，相关机理也有待明确。本研究以烫伤大鼠实验模型为实验对象，探究原花青素对其创面愈合及VEGF/VEGFR信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

原花青素（货号R606076）购于成都欧恩瑞思化学试剂有限公司；脱毛膏（货号201828545）购于镇平时通实业有限公司；烧烫伤膏（国药准字Z22021421）购于长春海外制药集团有限公司；乳酸林格氏液（货号ZC-A0302）购于上海茁彩生物科技有限公司；VEGF 抑制剂SB-267268（货号HY-19306）购于MCE 公司；苏木精—伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色试剂盒（货号BC-DL-001）购于南京生航生物技术有限公司；GAPDH 抗体（货号ab9485）、VEGF 抗体（货号ab150375）、VEGFR2 抗体（货号ab233693）购于abcam公司；羊抗兔二抗（货号A9169）购于德国Merck 公司；荧光定量PCR 仪（7500，ABI 公司）；凝胶成像系统（HE-120，上海生工生物有限公司）。

1.2 动物模型的构建

清洁级SD 雄性大鼠共计120 只，8 周龄，体重（300±10）g，许可证号SCXK(津)2020-0005，购于天津市中医药大学第一附属医院。将大鼠随机分为健康组、烫伤组、原花青素高剂量组、原花青素低剂量组、阳性对照组、原花青素+VEGF抑制组，每组20只。各组大鼠背部相同部位选取直径3 cm 的圆形区域，涂抹脱毛膏，均匀涂抹确保彻底去毛，消毒处理。而后将烫伤组、原花青素高剂量组、原花青素低剂量组、阳性对照组、原花青素+VEGF 抑制组大鼠麻醉，俯卧位固定于操作台上，将直径为2.5 cm的铁锤放于沸水中煮20 min，而后快速取出用无菌纱布擦干水分，将铁锤按压于大鼠背部脱毛处，确保铁锤与背部紧贴，但不形成皮肤凹陷，持续8 s，快速向大鼠腹腔内注射乳酸林格氏液3 mL，各组大鼠均单独饲养，防止相互抓伤背部烫伤组织。模型构建成功后，各组大鼠每日早中晚各用生理盐水清洗1次，滴加涂抹碘伏消毒，原花青素高剂量组消毒后在烫伤部位均匀涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理盐水溶解）；原花青素低剂量组均匀涂抹原花青素溶液（5 mg/mL，生理盐水溶解）；阳性对照组均匀涂抹烧烫伤膏；原花青素+VEGF抑制组涂抹原花青素溶液（30 mg/mL，生理盐水溶解），同时腹腔注射VEGF 抑制剂SB-267268（5 mg/kg），各组处理直至伤口完全愈合为止。

1.3 大鼠创面愈合指标检测

裁剪出直径为2.5 cm 的圆形半透明纸若干，称重记作半透明纸总重量，模拟大鼠背部烫伤皮肤组织。在大鼠烫伤模型构建后用药的第1、5、10、15、20 天分别于半透明纸上描绘各组大鼠背部创面图形，并称取背部创面图形区域的重量，通过公式计算创面愈合率。每天观察记录伤口出现上皮组织及伤口完全愈合时间，公式如下：

创面愈合率=（半透明纸总重量-背部创面图形区域的重量）/半透明纸总重量

1.4 大鼠创面组织病理学变化观察

伤口用药15 d后，各组随机挑选10只大鼠麻醉处理，剩余大鼠继续观察记录创面愈合情况。手术剪剪下麻醉大鼠背部完整的创面组织，部分组织充分剪碎后加入液氮研磨处理，放入-80 ℃冻存备用。剩余部分浸泡于8%福尔马林中固定，磷酸缓冲盐溶液清洗后，不同浓度的乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作切片（厚度4 μm），脱蜡至水，按照HE染色试剂盒说明书方法染色，树脂封片，上镜观察病理学变化。

1.5 创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA检测

取出冻存备用的创面组织粉末少许，加入少量Trizol，充分混匀，加入1 mL的氯仿，充分混匀，静置片刻，4 ℃12 000 r/min离心5 min，取上层清液加入等量的异丙醇，静置片刻后4 ℃12 000 r/min 离心5 min 后弃上清。加入0.5 mL 75%酒精反复吹打，晾干后加水溶解。检测提取的RNA浓度，定量后反转录，上机检测VEGF、VEGFR2 mRNA 的表达水平。mRNA 引物序列由Primer 3.1 软件设计，于广州吉赛生物公司合成。引物序列如下：①GAPDH Sense primer：5'-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，Antisense primer：5'-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3'；②VEGF Sense primer：5'-CCTGGCTTTACTGCTG TACCT-3'，Antisense primer：5'-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3'；③VEGFR2 Sense primer：5'-AACCATTGGTGAGACCATCGA-3'，Antisense primer：5'-GGTTCCGGTTCCCGTCTT-3'。

1.6 创面皮肤组织VEGF、VEGFR2蛋白检测

取出冻存备用的创面组织粉末少许，加入组织裂解液充分裂解，加入1 mL 提取液，静置片刻后4 ℃12 000 r/min离心5 min，收集蛋白，定量变性后加入孔道中，跑胶后转膜至PVDF膜，取出用脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（GAPDH 抗体、VEGF 抗体、VEGFR2 抗体，1∶1 500），4 ℃孵育过夜。TBST 清洗3 次，加入二抗（1∶1 000），常温孵育40 min，TBST 清洗3 次，将发光液混合倒于膜上，室温下浸泡2 min，而后取出，滤纸吸干多余液体，并置于Syngene光密度扫描系统上进行条带灰度分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件分析数据，计量资料用均值±标准差（）表示，组间差异比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原花青素对烫伤大鼠创面愈合指标的影响

烫伤大鼠愈合中的第1、5、10、15、20 天，与烫伤组相比，原花青素低剂量组、原花青素高剂量组、阳性对照组大鼠创面愈合率显著升高（P＜0.05）；与原花青素高剂量组相比，原花青素低剂量组、阳性对照组、原花青素+VEGF抑制组大鼠创面愈合率显著降低（P＜0.05），见表1。烫伤组大鼠上皮出现时间及伤口完全愈合时间显著长于原花青素低剂量组、原花青素高剂量组、阳性对照组（P＜0.05）；原花青素高剂量组上皮出现时间及伤口完全愈合时间显著短于原花青素低剂量组、阳性对照组、原花青素+VEGF抑制组（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠烫伤后不同时间创面愈合率的比较 ，%，n=10

表1 各组大鼠烫伤后不同时间创面愈合率的比较 ，%，n=10

与烫伤组相比，*P＜0.05；与原花青素高剂量组相比，#P＜0.05。

表2 各组大鼠烫伤后上皮出现时间、完全愈合时间的比较 ，n=10

表2 各组大鼠烫伤后上皮出现时间、完全愈合时间的比较 ，n=10

与烫伤组相比，*P＜0.05；与原花青素高剂量组相比，#P＜0.05。

2.2 原花青素对烫伤大鼠创面组织病理变化的影响

健康组大鼠具有正常的皮肤组织，上皮细胞排列紧密，具有明显的层次区分，真皮内纤维排列整齐，未出现炎细胞；烫伤组大鼠上皮组织完全坏死，层次增厚，真皮内纤维组织排列紊乱，出现大量炎症细胞；原花青素高剂量组大鼠上皮细胞逐渐增多，形成多个层次，真皮内纤维组织恢复正常，未见残留炎症细胞；原花青素低剂量组、阳性对照组、原花青素+VEGF抑制组上皮组织恢复较慢，层次尚未明确，真皮内纤维组织排列松散，残留少量炎症细胞，见图1。

图1 HE染色观察烫伤大鼠创面组织病理变化

2.3 原花青素对烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA表达的影响

烫伤组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA表达量显著高于健康组（P＜0.05）；原花青素低剂量组、原花青素高剂量组、阳性对照组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA 表达量显著高于烫伤组（P＜0.05）；原花青素高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA 表达量显著高于原花青素低剂量组（P＜0.05）；原花青素高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA表达量与阳性对照组、原花青素+VEGF 抑制组相比无显著差异（P＞0.05），见表3。

表3 各组烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA 表达量的比较 ，n=10

表3 各组烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA 表达量的比较 ，n=10

与健康组相比，*P＜0.05；与烫伤组相比，#P＜0.05；与原花青素高剂量组相比，※P＜0.05。

2.4 原花青素对烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白表达的影响

烫伤组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 蛋白表达量显著高于健康组（P＜0.05）；原花青素低剂量组、原花青素高剂量组、阳性对照组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 蛋白表达量显著高于烫伤组（P＜0.05）；原花青素高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 蛋白表达量显著高于原花青素低剂量组、原花青素+VEGF 抑制组（P＜0.05）；原花青素高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 蛋白表达量与阳性对照组相比无显著差异（P＞0.05），见图2、表4。

图2 各组烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白表达情况

表4 各组烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白的表达 ，n=10

表4 各组烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白的表达 ，n=10

与健康组相比，*P＜0.05；与烫伤组相比，#P＜0.05；与原花青素高剂量组相比，※P＜0.05。

3 讨论

烫伤作为一种常见的疾病，主要以体表皮肤的热损伤为主，可引起上皮细胞坏死，严重时会危害真皮下的纤维组织，严重影响人类的健康和生命安全[12]。古往今来，有多种中医药应用于烫伤的治疗，并在治疗烫伤的过程中取得了良好的效果，目前常见的治疗药物如烧烫伤膏就具有多种中医药成分[13]。然而，随着现代医学的发展，对于烫伤的治疗要求不再仅仅局限于消除疾病，还要注意确保患者在烫伤恢复的同时，快速形成创面愈合，以防止出现瘢痕，对患者造成困扰[14]。因此，开发快速形成创面愈合的药物成为重中之重。鉴于中医药在治疗烫伤的研究中已被证实具有很好的疗效，针对中医药的研究成为热点[15]。原花青素内含多种有机成分，具有强抗氧化性，还可保护细胞，促进细胞恢复，可加速组织愈合，推测原花青素很可能对于烫伤引起的皮肤损伤同样具有促进创面愈合的作用[16]。本研究通过使用加热的高温铁锤烫伤大鼠以构建模型，以烧烫伤膏治疗作为阳性对照，依据参考文献，将烫伤后各组大鼠的上皮出现时间、伤口完全愈合时间作为判断创面愈合情况的重要指标，并依据文献中创面愈合率的计算方法，统计不同时间段大鼠创面愈合率的变化情况[17-18]。发现烫伤后不同时间段，涂抹高剂量原花青素大鼠的创面愈合率显著高于涂抹低剂量原花青素和涂抹烧烫伤膏的大鼠，且涂抹高剂量原花青素大鼠的上皮出现时间及伤口完全愈合时间也显著低于涂抹低剂量原花青素和涂抹烧烫伤膏的大鼠，表明原花青素可以有效缓解烫伤，并加速创面愈合，且治疗效果优于常见治疗药物。

有文献指出，创面组织是外伤致病因子对皮肤造成直接伤害所形成的，是烫伤过程中受损最直接的皮肤组织，还是判断烫伤程度及恢复状况的重要组织结构[19]。通过HE 染色对各组大鼠创面组织的观察，发现烫伤后大鼠上皮组织完全坏死，真皮内纤维组织紊乱，且出现大量炎症细胞。涂抹低剂量原花青素和涂抹烧烫伤膏的大鼠上皮组织开始恢复，但恢复速度较慢，真皮内纤维组织依然松散，且存在少量炎症细胞。而涂抹高剂量原花青素的大鼠上皮组织出现大量的新生的上皮细胞，且真皮内纤维组织恢复正常，炎症细胞消失，表明原花青素对烫伤大鼠的上皮组织及真皮内纤维组织具有良好的缓解和保护作用，且效果优于常见治疗药物，但其作用机制还有待探索。

近年有文献指出，VEGF 作为细胞生长的重要生物因子，在受损伤组织中发挥重要作用。有研究证实，VEGF 的高表达可帮助恢复烫伤创面的血管形成，促进创面中晚期的愈合[20]。VEGF 高表达的同时促进其特异性结合受体VEGFR2的高表达，可参与调控血管内皮细胞增殖，加速血管生成，促进创面愈合[21]。本研究发现，烫伤大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表达量显著升高，原花青素高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表达量显著高于原花青素低剂量组，原花青素高剂量组与阳性对照组VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白表达量无显著差异，说明原花青素可能参与调控VEGF、VEGFR2的表达，通过促进其表达，加速创面的愈合，并具有剂量依赖性。为进一步验证这一结论，本实验在高剂量原花青素作用的同时抑制VEGF 表达，发现与原花青素高剂量组相比，原花青素+VEGF抑制组VEGF、VEGFR2蛋白表达量显著降低，同时，创面恢复明显减缓，创面愈合率显著降低，上皮出现时间、完全愈合时间显著延长。证实原花青素通过调控VEGF、VEGFR2 的表达，加速创面愈合。

综上所述，原花青素能调控VEGF/VEGFR信号通路中VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表达，促进上皮细胞新生，减轻炎症反应，使真皮内纤维组织恢复正常，加速创面组织的恢复，从而缓解烫伤危害。以上研究表明，原花青素对于烫伤具有良好的恢复作用，有很大的应用空间，可尝试用于开发治疗药物。VEGF/VEGFR 信号通路可能作为原花青素作用的重要靶点，但原花青素具有多种药物活性，参与多条通路的调节，通过何种通路调节烫伤创面组织的恢复，仍有待进一步的研究加以说明。