姜 嫄，黄锦明#，梁瑜祯 ，夏 宁

（1.广西医科大学第二附属医院，南宁 530007；2.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与机体代谢异常相关的代谢综合征，包括单纯性脂肪肝（NASFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化及肝细胞癌，其病理过程为从良性的单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最终导致肝硬化和肝细胞癌[1-2]。NAFLD发病机制尚不明确，现主要有“二次打击”假说和“多重平行打击”假说[3-4]，目前认为胰岛素抵抗（IR）、线粒体功能障碍、内质网应激等因素以及遗传和表观遗传因素等均参与NAFLD的进展[5]，其中肝纤维化的严重程度已被确定为NAFLD发病率和死亡率最重要预测因子，各种炎症刺激组织释放炎症因子，损伤肝脏，引起肝脏的纤维化[6]最终导致NAFLD。

铁死亡（Ferroptosis）是以铁依赖性脂质活性氧（LipROS）堆积引起脂质过氧化造成的细胞死亡为特征[7]。Tsurusaki 等[8]研究证实了铁死亡可能触发了单纯脂肪肝变性的炎症反应，促进NASH的发生发展[9]。因此，研究铁死亡对NAFLD 的影响，可为治疗NAFLD提供新的方向。

本研究采用GEO 数据库的GSE89632 数据集和铁死亡数据库（FerrDb），运用生物信息学方法分析NAFLD 肝组织中表达差异的铁死亡基因（Fe-DEGS）、疾病相关的信号通路、细胞功能及蛋白互作网络（PPI）。同时，建立体外NAFLD 细胞模型，进一步验证Fe-DEGS 基因的表达差异，为NAFLD疾病相关铁死亡机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析NAFLD潜在的铁死亡基因

1.1.1 数据来源 通过GEOquery包从GEO数据库中下载GSE89632 数据集，该数据集包含63 个样本[10]，取19例非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者和24 例健康对照（HC）者的肝脏基因表达（Illumina微阵列）进行分析，还从铁死亡基因数据库（FerrDb;zhounan.org）获得了一个包含259个基因的数据集。

1.1.2 数据处理及表达差异分析

通过箱式图查看样本标准化的情况，通过PCA图（ggplot2[3.3.3 版本]）查看样本分组间聚类情况，利用limma 包进行两组的差异分析，得到P值后进行多重假设检验和校正。通过控制错误发现率（FDR）来确定P值的阈值，并调整校正后的P值（q值）[11]。根据筛选标准|log2（FC）|＞1 &p.adj＜0.05，筛选表达差异基因（DEGS），并与铁死亡数据库取交集得铁死亡表达差异基因（Fe-DEGS），绘制铁死亡基因表达差异的韦恩图，为了更好地显示表达差异，分别用R软件的ggplot2[3.3.3版本]和Complex-Heatmap包[2.2.0版本]绘制火山图及热图。

1.1.3 GO-KEGG分析相关生物学功能及通路富集

GO-KEGG 富集分析是一种计算方法，用来确定一个预定义的基因集在两种生物状态（如两种表型）之间的生物学组成过程（BP），细胞成分（CC），分子功能（MF）及影响通路（KEGG）是否具有统计上显著的、一致的差异，利用R软件clusterProfiler包[3.14.3 版本]（用于富集分析）;org.Hs.eg.db 包[3.10.0 版本]（用于ID 转换）；GOplot 包[1.0.2 版本]（用于计算zscore）进行富集分析，p.adj＜0.05 &qvalue＜0.25 条件下对富集结果进行筛选，筛选结果利用ggplot2包[3.3.3版本]进行可视化分析[12]。

1.1.4 差异表达基因PPI网络的构建

通过在线工具STING（https：//strin g-db.org/），调节过滤条件参数：中可信度（0.40），下载网络关系信息，使用Cytoscape 软件（v3.8.0）对PPI 网络进行了可视化分析，利用cytohubb 插件进行关键基因的筛选[13]。

1.2 NAFLD细胞模型的建立与功能验证

1.2.1 材料

人肝癌细胞（Hep G2 细胞购自Procell），DMED培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.25%EDTA胰蛋白酶（购自Bi 公司），棕榈酸钠油酸钠试剂盒（购自西安鲲创生物有限公司），油红O 染色液试剂盒、牛血清白蛋白、甘油三脂检测试剂盒（购自Sigma公司），c-jun、Tristetraprolin（ZFP36）、ATF3、IL-6 单克隆兔一抗、β-Actin 多克隆兔一抗、Goat Anti-Mouse IgG2b 二抗（购自CST）；CO2细胞恒温培养箱（美国Thermo Forma 公司）、酶标仪（美国Thermo 公司）、荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）。

1.2.2 细胞培养方法

HepG2细胞用含10%胎牛血清+10万U/L青链霉素的DMEM培养基培养，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养，待细胞融汇至80%时，用0.25%ETDA 胰酶消化，将细胞传代用于后续实验。

1.2.3 NAFLD体外模型的建立

根据文献造模采用浓度1 mmol/L油酸钠（OA）和棕榈酸钠（PA）混合物即FFA（OA∶PA=1∶2）干预24 h[14-15]。接种HepG2于24孔板中，用无血清DMEM培养基培养，分为正常组、对照组、FFA 组并设置3 个复孔，细胞传代稳定至细胞融合度为60%～70%时撤去原有培养基，按正常组（只含无血清培养基）、对照组（含FFA 对照液的培养基）、FFA 组（含1 mmol/L FFA的培养基）干预24 h。

1.2.4 油红O染色观察细胞内脂滴

各组细胞干预24 h 后，倒掉培养基，PBS 洗涤细胞2 次；用含10%甲醛的磷酸盐缓冲液固定细胞10 min；PBS 漂洗3 次（3 min）；60%异丙醇浸洗5 min；室温下用已过滤的油红0 工作液染细胞20 min；弃去染色液，PBS 漂洗3～5遍至无残留染色液；苏木素复染2 min后弃去,PBS 漂洗3次；加入缓冲液1 min 后弃去；加入蒸馏水覆盖后用显微镜观察；显微镜下可见细胞内的中性脂肪可被特异性地染成棕红色。

1.2.5 细胞内甘油三脂含量测定

各组细胞干预24 h 后，收集细胞至离心管内，离心弃上清，加正庚烷和异丙醇（体积比1∶1）混合液1 mL，超声波破碎1 min（强度20%，超声2 s，停1 s），8 000 g，4℃离心10 min，取上清待测。将酶标仪预热30 min，调节波长到420 nm，蒸馏水调零；水浴锅预热到65 ℃；按甘油三酯含量检测试剂盒说明书配置相应的空白管、标准管和测定管；充分混匀，65 ℃水浴15 min，冷却后吸取200 μL 至96 孔板测定420 nm 处吸光度，记为A 空，A 标和A 测。（空白管和标准管需检测1～2 次。）根据试剂盒说明书提供的公式计算细胞内甘油三酯含量：细胞甘油三酯含量（mg/104cell）=C标准品×（A测-A空）÷（A 标-A空）÷细胞密度（C 标准品：1 mg/mL；细胞密度：104cell/mL）。

1.2.6 Western blotting 检测c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表达情况

各组细胞干预24 h后，按照RIPA蛋白裂解缓冲液使用说明书提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，等浓度稀释并加上样缓冲液后煮沸变性，配制12%SDS-PAGE 胶每孔上样10 μL，70 V 电泳至marker 分离加压至110 V 电泳至底部后，将目的蛋白切下，半干转将蛋白全部转移到0.22 µm PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入稀释后的IL-6、ATF3、c-jun、Tristetraprolin（ZFP36）的单克隆兔一抗（1∶1 000）和β-Actin 多克隆兔一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，再用稀释后的Goat Anti-Mouse IgG2b（1∶10 000）二抗室温孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，采用荧光显色，用Image J 软件进行灰度值分析。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参β-Actin灰度值。每组设3个平行孔，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）潜在的铁死亡基因

2.1.1 NASH铁死亡相关差异基因筛选结果及PPI网络的构建

取19 例非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者和24 例健康对照（HC）者的肝脏基因表达（Illumina微阵列）进行分析，来自GSE89632数据集的样本箱式图（图1A）样本标准化数据近似为直线和正态分布，PCA图（图1B）样本分组间聚类在同一平面上；根据筛选条件log2FC＞1或log2FC＜-1，P＜0.05，筛选出487 个差异基因，筛选出的差异基因与来自铁死亡基因数据库的259 个基因取交集得9 个NASH铁死亡基因（Fe-DEGS），绘制韦恩图（图1C），其中8个上调基因:JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3，1 个下调基因：FADS2，绘制其热图及火山图（图2A、B）。可视化分析显示，JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、PTGS2、IL-6间有网络关系（图2C）。

图2 基因筛查相关图

2.1.2 NASH 铁死亡相关差异基因功能及通路富集

利用R 软件clusterProfiler 和GOplot 包 对NASH铁死亡相关差异基因进行GO-KEGG富集分析，在p.adj＜0.05 &qvalue＜0.25 条件下对富集结果进行筛选，BP 共有275 条，CC 共有6 条，MF 共有21 条，KEGG 共有21 条；其关键功能及通路富集如下表（表1），并对其进行可视化分析（图3）。

图3 GO功能富集分析图

表1 GO-KEGG关键功能和通路的富集分析

2.2 NAFLD细胞模型的建立与功能验证

2.2.1 油红O染色观察细胞内脂滴

在FFA组内可见大量的棕红色颗粒，在对照组及正常组内棕红色颗粒明显减少。FFA 干预HepG2 细胞引起大量脂肪沉积（图4），因此FFA 干预后成功建立NAFLD细胞模型。

图4 细胞油红染色结果图

2.2.2 细胞内甘油三脂含量测定

与正常组、对照组比较、FFA组细胞内甘油三脂含量升高（P＜0.05）（图5），因此进一步表明FFA 干预后成功建立NAFLD细胞模型。

图5 细胞甘油三酯含量测定图

2.2.3 Western blotting 检测c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表达情况

与正常组、对照组比较，FFA 组c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 蛋白表达升高（P＜0.05）,见图6、表2。说明在NAFLD 细胞模型中c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6过表达。

图6 各组c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6蛋白的表达情况

表2 3组ATF-3、ZEP36、c-jun、IL-6蛋白表达量比较

表2 3组ATF-3、ZEP36、c-jun、IL-6蛋白表达量比较

与正常组和对照组比较，*P＜0.05。

3 讨论

NAFLD 发病率逐渐增高，已成为威胁人类健康的重大疾病，疾病的发展从单纯性脂肪变性到NASH，最终导致肝硬化和肝细胞癌。NAFLD的发病机制复杂，有研究表明，在NAFLD发病过程中发生铁死亡，但其中的机制并不明确，所以本文利用生物信息学解释NAFLD 发生铁死亡的相关机制。本研究根据GSE89632数据集和铁死亡基因数据库交集得出9 个（FADS2、JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3）Fe-DEGS基因。

本研究中通过GO-KEGG 富集分析Fe-DEGS基因主要在脂肪分化、氧化应激、三价铁（Fe3+）结合方面富集。其中脂肪细胞的异常分化导致NAFLD疾病的进展，主要表现在脂肪细胞的异位沉积和脂质因子的过表达等[16]，在“二次打击”学说中，NAFLD 肝细胞脂肪变性后加上氧化应激及脂质过氧化，使肝细胞及其线粒体发生持续性损伤[17-18]，在内质网应激反应和脂肪变性的过程中一些酶和转运蛋白的作用使Fe3+进入到细胞质和线粒体基质，变成具有氧化还原活性的二价铁（Fe2+），形成一个不稳定铁池，这些具有氧化还原活性的铁会通过芬顿反应催化产生ROS，铁依赖产生的LipROS 与脂质发生过氧化反应，从而诱导细胞铁死亡[19-20]。本研究中GO-KEGG 富集分析在IL-17 通路，而在NAFLD 小鼠模型研究中发现，IL-17 通路的激活可促进小鼠脂肪肝的形成，敲除通路中关键基因IL-17RA 基因可以抑制IL-17 通路，最后抑制NAFLD的发展[21]。因此，氧化应激等因素可能通过IL-17通路引起脂质的沉积和过氧化从而引起铁死亡。

本研究中筛选出的9 个（FADS2、JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、MIOX、PTGS2、IL-6、SLC2A3）Fe-DEGS 基因，根据PPI 网络可见JUN、ZFP36、SOCS1、ATF3、PTGS2、IL-6具有紧密关系，JUN 基因最早被发现是在禽类肉瘤病毒17（ASV17）复制缺陷的转化细胞中[22]，JUN 基因包括c-jun、junB 和junD 3 种基因，c-jun是核内转录因子（AP-1）家族成员之一，c-jun 可以防止肝脏内质网过度激活，从而减轻肝脏的损伤[23]；ZFP36也被称为锌指蛋白36，是锌指蛋白家族的成员，研究表明，ZFP36是慢性乙型肝炎感染过程中炎症反应的关键调节因子，抑制ZFP36 的表达，可以上调IL-6 等炎性细胞因子表达[24]，长期升高的IL-6 可促进小鼠肝脏和脂肪组织对胰岛素的抵抗[25]；ZFP36 过表达抑制脂肪细胞产生IL-6 蛋白，改善肝脏和脂肪组织胰岛素抵抗[26]。与此同时SOCS1蛋白促炎症细胞因子如TNFα、IL-6 的产生增加，导致肝脏缺血再灌注损伤和肝细胞缺氧/复氧损伤加重[27]。本研究结果显示，在FFA刺激HepG2细胞建立的NAFLD模型中细胞发生脂质沉积，western blotting结果提示c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 表达升高，JUN、ZFP36、IL-6、SOCS1具有相互作用关系，在调控NAFLD 炎症发生过程中起关键作用。因此，干预c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6 表达有望成为预防和治疗NAFLD 发生和发展的一大前景。

本研究中通过生物信息学方法及体外实验阐述了NAFLD 与铁死亡之间的关系，c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6在NAFLD发展过程中可能起关键功能，在NAFLD 中铁死亡基因c-jun、ZFP36、ATF3、IL-6表达升高，但是铁死亡与NAFLD 之间的机制过程需要进一步实验验证。因此，研究铁死亡机制在NAFLD 发病过程中的作用，有望为预防和治疗NAFLD提供新的方向28。