郑世榜，李永强，廖思娜，邱 华，廖小莉

（广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021）

乙型肝炎病毒（HBV）是一种噬肝DNA 病毒，可引起急性或慢性肝损伤[1]。当前，中国仍有慢性HBV感染者约7 000万例，每年因HBV相关性肝硬化、肝癌、肝衰竭死亡的患者达30 万人[2-3]。由于抗病毒药物核苷（酸）类似物、干扰素尚不能清除肝细胞内的HBV 病毒复制的模板cccDNA（covalently closed circular DNA），因此，探寻治愈HBV 及相关疾病的靶点或药物是当前研究的热点之一。

microRNA 是一种新发现的宿主与乙肝病毒（HBV）相互作用的新机制。前期研究表明，miR-122 作为肝脏中最特异、最丰富的microRNA，参与肝脏发育、分化和稳态以及代谢功能；在调控HBV复制及HCC中发挥关键性作用[4]。本课题组前期成功筛选的HBV 全基因组1.3 倍体HBV 稳转优势单克隆株HepGA14能为HBV相关肝硬化和肝癌的发病机制探索、治疗靶点发现和候选药物筛选等方面提供新的研究工具[5]。基于此，为系统探索miR-122与新的HBV 体外感染与复制模型HepGA14 上HBV表达活性的关系及调控机制，本研究采用miR-122 过表达/干扰表达慢病毒质粒干预后，观察HBVDNA、HBsAg、HBeAg 等标志物表达功能的变化，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2 细胞、293T 细胞购自上海诺百生物科技有限公司；HBV全基因组1.3倍体HBV稳转优势单克隆株HepGA14 细胞由课题组前期构建[5]；PDS019_pL 和PDS165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 载 体购自上海溪照生物科技有限公司，内切酶、GeneRuler DNA Ladder、Rnase Inhibitor和T4 DNA连接酶均购自美国Thermo 公司；质粒小抽试剂盒以及凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；0.05%Trypsin和lipofectamine 2000 购自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清购自法国Biowest 公司；Opti-MEM 购自美国GIBCO 公司；引物Oligo、Trizol Reagent、荧光染料SYBR Green I、oligo dT/Random primer/特异性引物、逆转录酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase、Platinum Taq DNA Polymerase、100mM dNTPs、DEPC H2O 购自美国invitrogen 公司；基因序列、引物合成、测序交由上海诺百生物科技有限公司完成；HBeAg、HBsAg 检测试剂盒购自上海东寰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 293T 细胞、HepG2 和HBV 全基因组1.3 倍体HBV 稳转优势单克隆株HepGA14 细胞培养在含10%小牛血清的DEME培养基中。

1.2.2 miR-122 过表达载体构建 miR-122 的成熟序列来自Sanger microRNA序列数据库（miRBase），设计miR-122 的过表达Oligo，正向引物PDS19-miR122-F：5'-CACCGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGCGAACAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS19-miR122-R：5'-AAAATGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTTCGCAAACACCATTGTCACACTCCAC-3'，酶切位点为BsmBI。以含有待扩增序列的DNA 为模板进行PCR 扩增。25 μL 反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Primer F/R 1 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，（10 mmol/L）dNTPs 0.25 μL，Nuclease free water 18 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，循环：95 ℃变性20 s；67 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共35 个循环，72 ℃延长3 min，4 ℃保存。经退火后，重组至PDS019_pL 载体中，测序验证。退火反应体系：10×Oligo Annealing Buffer 2 μL，引 物F（200 μmol/L）5 μL，引物R（200 μmol/L）5 μL，ddH2O 8 μL。退火反应条件：95 ℃5 min，72 ℃5 min，自然降温至PCR 的Block 温度（25 ℃）。

1.2.3 miR-122干扰载体构建 设计miR-122的干扰Oligo，正向引物PDS165-shmiR122-F：5'-CAACCAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS-165-shmiR122-R：5'-CTTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'。正向引物酶切位点为BsmBI，反向引物酶切位点为BveI。以含有待扩增序列的DNA 为模板进行PCR 扩增。25 μL 反应体系以及PCR 反应条件同“1.2.2项”。经退火后，重组至PDS 165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 载体中，测序验证。退火反应体系以及退火反应条件同“1.2.2项”。

1.2.4 miR-122 过表达和干扰慢病毒包装和滴度测定 构建好的miR-122 过表达/干扰慢病毒载体分别与包装质粒（packaging mix）共转染293T细胞，包装慢病毒，收集病毒液，48 h 后测定慢病毒活性滴度。RT-qPCR 反应体系：ddH2O 6.55 μL、10×PCR buffer 1 μL、Mg2+（50 mmol/L）0.4 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL、Primer F/R（10 μmol/L）0.5 μL、Probe（FAM）（10 μmol/L）0.25 μL、Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL、Template 1 μL、Total volume 10 μL；RT-qPCR反应条件：95 ℃10 s、60 ℃30 s，40个循环。

1.2.5 miR-122 过表达和干扰慢病毒侵染HBV 1.3D-HepG2细胞及抗生素筛选

（1）慢病毒侵染HBV全基因组1.3倍体HBV稳转优势单克隆株HepGA14 最佳MOI 值:含8µg/mL polybrene 的完全培养液重悬靶细胞，按每孔第2 天细胞密度60%～70%的数量接种于96 孔板的各孔，设1个复孔。取出阴性对照病毒液，冰上融化，慢病毒MOI=0、2、5、10、30、60、120、240，向每孔加入病毒液。培养6 h 后，更换成完全培养液后继续培养至24 h～96 h；荧光显微镜下观察细胞荧光表达，明确最佳MOI，并拍摄白光和荧光视野下照片。（2）抗生素筛选:对数生长期的HepGA14细胞，以5×105/孔密度接种于12孔板;培养孔换上新配制的完全培养基+8 µg/mL ploybrene 的感染培养基，按照MOI 测定值的病毒液侵染HepGA14 细胞，培养4～6 h，更换完全培养基，继续培养24～72 h，加入梯度为0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL 的抗生素进行筛选;根据细胞状态确定抗生素筛选周期，培养和冻存筛选成功的稳转细胞系。

1.2.6 RT-qPCR 检测miR-122 表达量 使用Hep-GA14 稳转细胞和同样细胞数的HepG2 细胞沉淀，抽提总RNA，逆转录得cDNA 放-20 ℃备用保存。采用RT-qPCR 法对miR-122 进行扩增。反应体系共25 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，正向 反向引物（10 μmol）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 s；95 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s；40 个循环；添加溶解曲线。miR-122正向引物序列为：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGAGTGTGACAATGG-3'，反向引物序列为：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 正向引物序列为：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列为：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。采用2-△△CT法进行相对表达水平定量分析。实验重复3次。

1.2.7 RT-qPCR检测miR-122过表达和干扰慢病毒侵染HBV 全基因组1.3 倍体HBV 稳转优势单克隆株HepGA14的miR-122表达量 miR-122过表达和干扰慢病毒分别以MOI 值=30 侵染HepGA14 稳转细胞，48 h 后收集部分细胞，qPCR 检测miR-122 表达水平，检测方法同“1.2.6项”，实验重复3次。

1.2.8 ELISA 检测上清HBsAg 和HBeAg 水平 收集细胞上清，操作按试剂盒说明书进行，实验重复3次。

1.2.9 RT-qPCR检测上清HBV DNA表达量 提取细胞沉淀的总RNA，采用RT-qPCR 检测HBV DNA的表达水平，HBV DNA 的检测引物的正向引物为5'-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'，反向引物为：5'-CAGCAGGATGAAGAGGAA-3'，以18S rDNA 为内参，扩增引物为引物18S-F（序列5'-GAATTGACGGAAGGGCACCAC-3'）和18S-R（序 列5'-AAGAACGGCCATGCACCACCA-3'）。采用2-△△CT法进行相对表达水平定量分析，实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-122 过表达载体构建 获得测序正确的miR-122 过表达慢病毒载体CL1044-PDS19_miR122。测序结果完全符合，无突变，表明miR-122过表达慢病毒载体构建成功，见图1。

图1 CL1044-PDS19_miR122 载体的测序图谱

2.2 miR-122 干扰载体构建 获得测序正确的miR-122 干扰慢病毒载体CL1043-PDS160_shmiR122。测序结果完全符合，无突变，表明miR-122干扰慢病毒载体构建成功，见图2。

图2 CL1043-PDS160_shmiR122 载体的测序图谱

2.3 慢病毒滴度及侵染HBV 全基因组1.3 倍体HBV 稳转优势单克隆株HepGA14 细胞的MOI 测定 浓缩后的慢病毒侵染293A细胞，48 h后抽提细胞基因组。测定病毒滴度为3.24×108TU/mL。MOI=30～60时，综合分析细胞状态较好，阳性比例达到85%以上，符合后续实验要求，见图3。选取MOI=30进行后续实验。

图3 慢病毒侵染HepGA14 细胞的侵染效率

2.4 HepG2和HBV1.3D-HepGA14细胞miR-122表达量 HBV1.3D-HepGA14细胞来源于HepG2 并稳定含有转染的HBV 全长基因组（ayw 亚型）。本研究使用HBV1.3D-HepGA14 细胞作为HBV 复制的模型系统，因为它能组成性表达乙型肝炎表面（HBsAg）抗原和E（HBeAg）抗原，并且还支持HBV复制，HBx、cccDNA、HBVDNA 的表达丰度更高[5]。结果发现，HBV1.3D-HepGA14 细胞（0.244±0.005）比在HepG2 细胞（1.000±0.018）中miR-122 的水平下降了70%多（t=71.467，P＜0.000 1），见图4。表明HBV 复制和感染的存在可能导致miR-122 表达下降。

图4 RT-PCR 检测HBV1.3D-HepGA14 细胞中miR-122 RNA的表达情况

2.5 miR-122 过表达/干扰慢病毒侵染HBV1.3DHepGA14 细胞稳转细胞 miR-122 过表达/干扰慢病毒侵染HepGA14 稳转细胞可上下调miR-122 表达。与HepGA14（对照组）比较，HepGA14-VL1044（过表达组）miR-122可上调达到779倍（t=-22.878，P＜0.000 1），HepGA14-VL1043（干扰组）干扰效率可到55.03%（t=30.125，P＜0.000 1），见图5。

图5 miR-122 过表达/干扰慢病毒侵染HBV1.3D-HepGA14细胞稳转细胞

2.6 过表达和干扰miR-122对HBVDNA复制、HBsAg 表达和HBeAg 表达的影响 与对照组Hep-GA14 细胞相比，过表达miR-122 后HBV DNA（t=95.925，P＜0.000 1）、HBeAg（t=92.338，P＜0.000 1）、HBsAg（t=60.706，P＜0.000 1）的表达均下降。干扰miR-122 后HBV DNA（t=-45.084，P＜0.000 1）、HBeAg（t=-22.512，P＜0.000 1）、HBsAg（t=-44.146，P＜0.000 1）的表达均上升。RT-qPCR 检测细胞上清HBV DNA表达结果和ELISA法检测3种细胞上清HBsAg和HBeAg表达，结果见图6。

图6 过表达和干扰miR-122对HBVDNA复制、HBsAg表达和HBeAg表达的影响

3 讨论

目前，我国乙型肝炎病毒（简称乙肝）的患病率仍高于其他国家的平均水平。而临床指南一线推荐的两大抗病毒用药干扰素和核苷（酸）类似物都无法干预到超螺旋结构cccDNA（HBV 基因组物质），这成为了慢性乙型肝炎难以治愈的主要原因[6]。然而，乙肝患者体内持续存在的HBV病毒，是发展为原发性肝癌（HCC）的最主要的危险因素。因此，寻找以及研究灵敏的分子标志物有助筛选早期的乙肝患者，给予合适的治疗，延缓疾病的进展，是目前临床亟待解决的关键问题。

乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科，其感染人体肝脏后常引起微小RNA 表达的变化。miR-122作为肝脏独有的含量最高的微小RNA，占肝脏微小RNA 总量的近70%[7]。其在调节肝细胞分化、增殖、凋亡以及代谢方面中起着关键的作用。研究发现，与健康对照组相比，HBV 感染患者肝脏中miR-122 表达显着下调，且随着miR-122 的表达水平下降，肝细胞内的HBV 病毒载量和坏死性炎症会增加[8]。然而，Ji等[9]发现miR-122在HBV感染患者的血清中显著上调，且可抑制Huh7 和HepG2 细胞中乙肝病毒的复制。因此，分析miR-122对HBV 复制作用具有重要意义，有助于提高乙肝病毒感染以及相关疾病患者的疗效。

本课题组在前期已经成功筛选出HBV 全基因组1.3倍体HBV稳转优势单克隆株HepGA14，较传统的HepG2.2.15 细胞株，可更加稳定、高效地表达反映HBV 的复制/感染情况的标志物：HBsAg、HBeAg、HBx、HBVDNA、cccDNA 等。本研究将构建的miR-122的过表达载体CL1044-PDS19_miR122/CL1043-PDS160_miR122干扰载体转染优势单克隆株HepGA14，并成功建立过表达/干扰miR-122 的HepGA14 细胞系，为研究miR-122 相关作用机制提供了良好基础。检测结果表明，miR-122 过表达后对HepGA14的HBsAg和HBeAg的合成和分泌产生明显抑制作用，且显著下调HBV DNA的滴度，而干扰miR-122后能明显促进HepGA14细胞的HBsAg、HBeAg的表达及上调HBV DNA滴度。表明在细胞水平上miR-122 能够调控HBV 的复制。本研究的结果与Chen等[10]团队的研究结论相符。此外，本研究以HepG2、HBV1.3D-HepGA14为研究模型，通过检测其miR-122 表达，证实了在乙肝病毒感染的情况下，肝细胞中miR-122 表达受到了下调。miR-122 是HCC 的重要肿瘤抑制因子，与转移和不良预后相关[11]。Hsu 等[12]研究发现miR-122 的缺失使小鼠易患肝细胞癌。Li 等[13]发现miR-122 在HCC 中低表达，而将miR-122 过表达后会抑制肝癌细胞的侵袭、增殖和迁移能力。Wu[14]研究团队发现，miR-122可以通过调节I型干扰素（IFN）的表达来保护肝细胞免受HBV感染。但miR-122 对HBV复制作用尚存有争议。QIU等[15]学者发现miR-122可显著下调HO-1的表达，间接促进HBV核心蛋白的表达，进而增强HBV复制。然而，miR-122被证明通过降低细胞周期蛋白G1 的表达来间接干扰HBV 的复制，从而导致p53 介导的HBV 转录受到抑制[8]。miR-122还被证实可影响核心蛋白mRNA的稳定性和翻译，以及前基因体（pgRNA）的稳定性，从而抑制HBV基因的表达/产生[10]。因此，鉴于miR-122在肝脏中的广泛作用，miR-122调控HBV的确切机制有待进一步研究。

目前，调节miRNA表达是辅助治疗乙型肝炎以及相关疾病的一个有前景的前沿领域，可与经典抗病毒治疗相结合，使患者获得更大的收益。本实验成功建立稳定过表达/干扰miR-122 的HBV 稳转优势单克隆株HepGA14细胞系，并确定miR-122在细胞水平上对HBV 复制具有一定的调控作用。但是其如何调控HBsAg、HBeAg、HBV-DNA 表达及抗HBV 机制尚未清楚，需要进一步的探索。基于目前研究结果，构建的过表达/干扰miR-122的HepGA14细胞模型能为新型抗HBV 药物的开发提供有力的工具，具有积极的研究意义。