陈 平，魏雪梅，谈丽丽

（青海省第五人民医院眼科，西宁 810000）

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常见并发症，也是患者视力障碍和失明的主要原因[1]。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞是视网膜屏障的重要组成部分，也是维持视觉系统正常功能的关键因素[2]。持续的高血糖刺激会诱导RPE 细胞的氧化应激和细胞凋亡，从而促进血视网膜屏障损伤和DR进展[3]。自噬激活能够清除氧化应激诱导的RPE 细胞受损的细胞器和毒性物质，减轻细胞损伤[4]；缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可通过调控E1B-19 ku 相互作用蛋白3（adenovirus E1B 19 kuinteracting protein 3，BNIP3）促进自噬，并在缺氧的人神经母细胞瘤细胞中发挥神经保护作用[5]。七叶亭在糖尿病、肥胖、心血管疾病等中具有预防和抵抗氧化应激、炎症反应等作用[6-7]。而且，七叶亭对糖尿病性神经病的治疗效果显著[8]。目前，对于七叶亭在DR 中的作用机制还少有研究，故本研究通过高糖诱导RPE细胞，分析不同浓度七叶亭处理对HIF-1α/BNIP3通路介导的自噬的影响，为七叶亭治疗DR提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

人RPE细胞系ARPE-19，美国ATCC细胞库；七叶亭（98%，246573），美国Sigma 公司；DMEM/F12培养基（A4192001）、胎牛血清（16140063）、青霉素-链霉素（15070063）、胰蛋白酶（15050057），美国Gibco 公司；2-甲氧雌二醇（2-Methoxyestradiol，2ME2）（S1233），美国selleck 公司；兔抗人β 连环蛋白（β-catenin）（ab32572）、自噬微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）（ab48394）、Beclin-1（ab207612）、HIF-1α（ab51608）、BNIP3（ab109362）、GAPDH（ab234437）、辣根过氧化物酶标记二抗（ab205718），英国Abcam 公司；蛋白提取试剂盒（P0033）、BCA 蛋白定量试剂盒（P0012）、细胞计数盒8（CCK-8）试剂盒（C0037）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（S0033），上海碧云天生物公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）（ml077385）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）（ml058097）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，上海酶联生物公司。

荧光显微镜，日本Olympus 公司；Multiskan FC酶标仪，美国赛默飞世尔公司；EM UC7 超薄切片机，德国Leica 公司；H-7500 透射电子显微镜，日本日立公司；UVP凝胶成像系统，美国UVP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

ARPE-19细胞加至含有10%胎牛血清、1%青霉素—链霉素的DMEM/F12 培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度达到80%左右时进行传代，细胞生长至对数期时进行后续实验。

1.2.2 细胞处理

收集“1.2.1 项”中培养至3～5 代的APRE-19 细胞，并分为对照组：含5.5 mmol/L 葡萄糖培养液培养）；高糖组：含25 mmol/L 葡萄糖培养液[9]；七叶亭（1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组：加入含25 mmol/L 葡萄糖和（1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）七叶亭溶液[10]；七叶亭+2ME2 组：加入含25 mmol/L 葡萄糖、5.0 μmol/L 七叶亭和1.0 μmol/L的2ME2 培养液[11]，各组均置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。

1.2.3 细胞活性测定

收集“1.2.2 项”中各组APRE-19 细胞，以5×103个/孔的浓度加至96 孔板，加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃避光培养4 h，弃上清，酶标仪490 nm波长处检测每孔吸光度OD 值，计算细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

提取“1.2.1项”中各组细胞总蛋白，BCA检测试剂盒测定浓度，对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入一抗β-catenin、GAPDH，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h。蛋白凝胶成像系统成像，Image Pro Plus 6.0图像软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.4 ROS水平测定

收集“1.2.2项”中各组APRE-19细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，加至10 μmol/L 的DCFH-DA（无血清培养液稀释）中，37 ℃，孵育20 min，流式细胞仪488 nm激发波长和525 nm发射波长检测ROS荧光强度。

1.2.5 炎症因子水平测定

收集各组APRE-19 细胞，4 ℃，3 000 r/min 离心，收集上清。利用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-6的水平。

1.2.6 细胞自噬水平检测

收集“1.2.2 项”中各组APRE-19 细胞，2 000 r/min 离心5 min，弃上清。4 ℃，2.5%戊二醛固定24 h，1%四氧化锇固定2 h。乙醇脱水后，将其制成50 nm 的树脂切片，3%醋酸铀—橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察细胞超微结构并拍照。按照“1.2.3 项”中的方法测定各组APRE-19 细胞中蛋白Beclin1、LC3的相对表达水平。

1.2.7 HIF-1α/BNIP3通路蛋白表达测定

根据“1.2.3 项”中的蛋白测定方法检测各组APRE-19 细胞中蛋白HIF-1α、BNIP3 的相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。计量资料采用平均数±标准差（）描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞活力的影响

与对照组比较，高糖组细胞活力、β-catenin表达显著降低（P＜0.05）；与高糖组比较，七叶亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组细胞活力、β-catenin表达依次升高（P＜0.05）；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，七叶亭+2ME2组细胞活力、β-catenin表达显著降低（P＜0.05）（表1，图1）。

图1 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞增殖蛋白的影响

表1 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞活力的影响 n=6，

表1 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞活力的影响 n=6，

与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，cP＜0.05。

2.2 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞ROS含量的影响

与对照组比较，高糖组ROS含量显著升高（P＜0.05）；与高糖组比较，七叶亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组ROS 含量依次降低（P＜0.05）；七叶亭+2ME2 组ROS 含量显著高于5.0 μmol/L 七叶亭组（P＜0.05）（表2，图2）。

图2 荧光显微镜观察ARPE-19细胞ROS荧光图像（×200）

表2 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞ROS含量的影响 n=3，

表2 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞ROS含量的影响 n=3，

与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，cP＜0.05。

2.3 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞炎症因子的影响

与对照组比较，高糖组TNF-α、IL-6水平显著升高（P＜0.05）；与高糖组比较，七叶亭处理组（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）TNF-α、IL-6水平显著降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，七叶亭+2ME2组TNF-α、IL-6水平显著升高（P＜0.05）（表3）。

表3 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞炎症因子水平的影响 n=3，

表3 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞炎症因子水平的影响 n=3，

与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，cP＜0.05。

2.4 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞自噬的影响

与对照组比较，高糖组自噬小体数目增多；与高糖组比较，七叶亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组自噬小体/自噬泡数目增多；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，七叶亭+2ME2组自噬小体数目减少（图3）。

图3 透射电镜观察APRE-19细胞的自噬

高糖组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著高于对照组（P＜0.05）；七叶亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组HIF-1α、BNIP3 表达显著高于高糖组，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；七叶亭+2ME2 组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著低于5.0 μmol/L 七叶亭组（P＜0.05）（表4，图4）。

图4 WB检测各组自噬蛋白的表达

表4 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞自噬蛋白的影响 n=3，

表4 七叶亭对高糖诱导的APRE-19细胞自噬蛋白的影响 n=3，

与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，cP＜0.05。

2.5 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞HIF-1α/BNIP3通路蛋白的影响

与对照组比较，高糖组HIF-1α、BNIP3 表达显著升高（P＜0.05）；与高糖组比较，七叶亭（1 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L）处理组HIF-1α、BNIP3 表达显著升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05）；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，七叶亭+2ME2 组HIF-1α、BNIP3 表达显著降低（P＜0.05）（表5，图5）。

表5 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影响 n=3，

表5 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影响 n=3，

与对照组比较，aP＜0.05；与高糖组比较，bP＜0.05；与5.0 μmol/L七叶亭组比较，cP＜0.05。

图5 七叶亭对高糖诱导的APRE-19 细胞HIF-1α/BNIP3 通路蛋白的影响

3 讨论

DR 是糖尿病性微血管病变最主要的表现，也是工作年龄段的成年人致盲的主要原因之一[12]。RPE细胞位于脉络膜和视网膜之间，其侧面与毗邻细胞的包膜之间形成不同宽度的细胞间隙，形成紧密连接，构成血-视网膜屏障[13]。RPE 细胞是DR 进程中最重要的细胞，研究表明，高血糖导致的氧化应激和炎症反应在DR 进程中起关键作用[14-15]。本研究通过高糖诱导AEPR-19 构建RPE 细胞损伤模型，结果显示，高糖组细胞活力、β-catenin 表达显著降低，ROS 含量、TNF-α、IL-6 水平显著升高，这与Qian 等[16]研究结果一致，提示高糖可能通过氧化应激诱导ARPE-19细胞损伤，抑制氧化应激对RPE细胞损伤的作用可能减缓DR进程。

七叶亭又称为6,7-二羟基香豆素，具有抗炎、抗氧化、血管保护等多种病理作用。Zhang 等[17]报道七叶亭能够降低人角膜上皮细胞中ROS含量，使其免受氧化损伤。Srilatha 等[8]研究发现，七叶亭可显著降低糖尿病周围神经病变大鼠血清糖化血红蛋白含量和过氧化物酶活性，进而改善大鼠的协调性和行为功能。Xu等[18]指出，七叶亭通过抑制氧化应激引起的自噬减轻短暂性双侧颈动脉闭塞小鼠模型的神经功能缺损。本研究结果表明，七叶亭可抑制高糖诱导的ARPE-19 细胞ROS 含量及炎症因子水平，促进细胞增殖，提示七叶亭可能抑制高糖诱导的ARPE-19细胞损伤。

自噬在真核细胞内广泛存在，通过消除细胞内受损细胞器和蛋白质维持细胞内稳态。研究显示，棕榈酸和油酸处理可导致肝癌细胞自噬[19]。也有研究表明，高糖环境下自噬激活能够清除细胞中的毒性物质及受损线粒体等细胞器，维持细胞内环境稳定，延缓DR 进程[4]。本研究发现，高糖诱导促进AEPR-19 细胞的自噬，自噬蛋白beclin1、LC3 表达显著升高，提示自噬可能与DR发生有关。HIF-1在人和哺乳动物体内广泛分布，缺氧环境下，ROS 的产生能够激活HIF-1α，进而调控下游靶基因，维持细胞稳态[20]。BNIP3正常生理条件下处于低表达状态，当细胞缺氧、缺血时，HIF-1α可结合HIF-1β形成复合体，激活BNIP3。Feng等[21]研究表明，BNIP3过表达能够诱导自噬，而敲除BNIP3会加重RPE细胞D407的缺氧损伤。Fu等[22]研究表明，HIF-1α/BNIP3通路介导的自噬能够通过抑制ROS 生成减轻缺血再灌注引起的急性肾损伤。本研究结果表明，高糖诱导下蛋白HIF-1α、BNIP3 表达显著升高，提示HIF-1α/BNIP3 信号通路介导的自噬参与DR 发展。2ME2 是HIF-1α 的特异性抑制剂，可抑制HIF-1α/BNIP3 通路激活，从而影响自噬。本研究通过在高糖诱导的APRE-19细胞中添加2ME2来分析七叶亭对细胞自噬的调控作用及其与HIF-1α/BNIP3 通路的关系。结果显示，2ME2 逆转了七叶亭对高糖诱导的ARPE-19 细胞损伤的保护作用，其细胞活力、β-catenin 表达、ROS 含量、TNF-α、IL-6 水平均得到恢复。而且，2ME2 可使七叶亭对高糖诱导的ARPE-19细胞自噬的促进作用、HIF-1α、BNIP3蛋白的上调表达得到逆转。猜测七叶亭可能通过促进HIF-1α/BNIP3 信号通路介导的自噬减轻高糖对ARPE-19 细胞的损伤，与以上研究结果不一致，原因可能是不同刺激和细胞环境下，自噬可以促进细胞凋亡，轻度自噬有利于对细胞的保护，而自噬过度则会引起细胞凋亡[4]。因此，有关七叶亭影响HIF-1α/BNIP3 通路介导的自噬在DR 中的可能机制，还需进一步的深入研究。

综上所述，七叶亭可能通过促进HIF-1α/BNIP3信号通路介导的自噬减轻高糖对ARPE-19 细胞的损伤，可能为DR临床治疗提供参考依据。然而，本研究仅从细胞水平上分析了七叶亭在DR治疗中的可能机制，下一步需结合基础实验对其机制和作用进行验证。