刘梅 张瑞 毛亚菲 高占玺 史敏

侵袭性NK细胞白血病(ANKL)是一种少见类型的恶性淋巴细胞增殖性疾病[1-3]，于1986年首次报道[4]，属于系统性NK细胞肿瘤，临床过程中普遍以恶性NK细胞浸润和侵袭性为特点。NK细胞显著的形态为大颗粒细胞(LGL)，占淋巴样细胞的1/3。ANKL通常存在于东亚地区，在亚洲人群中发病率较高，主要见于青年至中年成人，中位发病年龄为30～40岁，男女比例未见明显异常[5,6]。ANKL病程短，病情进展迅速，主要侵犯的部位为骨髓、外周血、肝脏、脾脏和淋巴结等，皮肤受累罕见。约25% 的患者伴类风湿关节炎，有些合并脾大、中性粒细胞减少 ，与 Felty’s综合征非常相似。有时患者可合并纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、骨髓增生异常综合征、神经性疾病、实体肿瘤、内分泌疾病及意义未明的巨球蛋白血症等。少部分患者可反复出现多种自身免疫性血细胞减少。临床特征主要包括数周或数月发热、乏力、盗汗、食欲减退、体重减轻、黄疸等全身症状，通常合并噬血细胞增多症(HPS)、弥漫性血管内凝血(DIC)等，最终导致多器官脏器功能衰竭。ANKL的诊断方法发展缓慢，这在很大程度上是由于疾病的罕见程度以及临床和病理表现的复杂性。另一方面缺乏ANKL特定的免疫表型或分子生物学特征。大多数早期研究借以流式细胞术和常规核型分析等辅助手段，为ANKL的诊断提供一套系统的诊断方法。虽然这些技术手段很强大，但并没有发现特定的生物标志物，尤其是对于NK细胞肿瘤。近年来，DNA和RNA水平的高通量基因组分析极大地促进了我们对ANKL的认识，并为潜在的靶向治疗提供了新的依据[7]。大量研究表明，ANKL与Epstein-Barr病毒(EBV)密切相关[8,9]，只有10%的ANKL病例EBV阴性[10]，治疗过程中对多种化疗方案反应不佳，中位生存期一般短于1年[11,12]。本文结合近年ANKL的诊疗进展进行简述。

1 ANKL的病因与发病机制

ANKL是一种与逆转录EBV感染密切关联的成熟NK细胞增殖性疾病。有学者研究认为，定量监测EBV含量可以有效衡量患者体内的肿瘤负荷以及评估中枢神经系统病变的情况，经有效的方案治疗或者造血干细胞移植后，患者体内检测EBV含量会明显下降[13,14]。虽然ANKL与EBV感染有确定的联系，但EBV阴性的ANKL也得到了广泛认识[15-17]。与EBV阳性ANKL相比，EBV阴性病例多发于老年患者中，并且在亚洲和非亚洲人群中的发病率相等。EBV阳性与EBV阴性的ANKL在形态学或免疫表型上没有差异[15]。在部分ANKL病例中，EBV的缺失可能会导致诊断延误，从而造成不良的临床后果。在评估ANKL的潜在病例时，不应将EBV阴性状态作为排除诊断的标准。

近年来，高通量研究的进展使人们对发病机制有了深刻的认识。随着新一代测序技术的研究，已经阐明了ANKL 的分子改变，并且鉴定了几种信号传导途径中的功能障碍。ANKL的分子异常可分为三大类：JAK/STAT通路激活、表观遗传失调、TP53和DNA修复受损[7]。这些高通量数据也提供了潜在的治疗靶点，有望改善ANKL患者的治疗和预后。有临床研究对大量ANKL患者进行了转录组测序，基因组测序、细胞因子谱检测等多组学综合分析，并通过功能实验验证发现了ANKL重要的分子生物学特征是异常激活了Janus激酶(JAK)/转录活化因子(STAT)-转录因子(MYC)-生物合成轴，ANKL患者中NK细胞呈现显著的STAT3磷酸化激活，使c-MYC高表达，STAT3通路激活显著增高炎性因子IL-10水平，所以激活STAT3磷酸化和高表达c-MYC对于ANKL细胞的生存增殖起着关键作用，STAT3通路信号调节c-MYC转录程序，同时STAT3通路信号激活和c-MYC转录也是维持ANKL核苷酸代谢和糖酵解途径中所必需的，所以ANKL基因的改变和激活IL-10下游的主要靶点是JAK/STAT-MYC-生物合成通路。Huang等[18]研究表明，STAT3信号可以通过产生过量IL-10或通过其他未知的机制被激活，而不受基因突变的影响。这一观察得到了免疫组织化学分析的支持，免疫组织化学分析表明，与对照组相比，在JAK/STAT野生型和突变的NAKL病例中，其骨髓中的肿瘤细胞中磷酸化STAT3(p-STAT3；指示激活)显著增加。在表观遗传学方面，Huang等[18]发现了包括TET2(28%)、CREBBP(21%)和MLL2(21%)在内的表观遗传修饰相关基因的突变。相比之下，在结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型(ENKTL)[19]中常见的DDX3X和BOCR在ANKL中突变较少，同时还存在TET2、CREBBP和GFI1突变[20]。另外，Huang等[18]在34%的ANKL病例中发现了TP53突变。Dufva等[21]在14名患者中发现1例TP53突变。Hussein等[7]的研究中6例患者中发现有3例TP53突变。

Gao等[22]研究发现，ANKL的突变启动因子是转录活化因子5(STAT5)-N642H，同时ANKL患者中还存在一个常见指标，HACE1CpG-177位点超甲基化，而且这些患者EBV均为阳性。 Nicolae等[23]研究显示EBV阴性的患者体内也存在STAT3的突变以及不同程度转导信号的激活，这种突变提示与源自NK/T大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)中NK细胞的LGL类似。EBV阴性的患者经有效方案治疗后可以缓解，也有少数患者在较短时间内会出现复发现象[10,23]，然而，也有学者报道EBV阴性的患者可以有较长的生存期[24]，Ko等[10]证明EB病毒阴性的ANKL预后较EB病毒阳性的ANKL患者预后好，二者的中位生存时间分别为11.5个月和21.5个月，但例数有限，分别为2例和14例。

ANKL病程终末期通常会出现全血细胞减少，高三酰甘油血症，低纤维蛋白血症，血清铁蛋白增高，NK细胞活性降低，符合诊断其噬血细胞综合征(HPS)进而发生弥散性血管内凝血(DIC)。噬血细胞综合征(HPS)的主要原因是其感染EBV的肿瘤细胞上调表达了肿瘤坏死因子(TNF)，TNF再与干扰素(INF)及其他细胞因子共同作用激活了巨噬细胞系统。还发现ANKL的患者中具有高血清水平的CXCR1,CCR5和可溶性Fas配体，启动了趋化因子系统在其细胞浸润中的作用。

2 ANKL的诊断及实验室特征

2008年世界卫生组织(WHO)分类[25]标准在淋巴组织肿瘤分类中将结外NK/T细胞淋巴瘤、慢性NK细胞淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)及ANKL一起划分为成熟NK细胞肿瘤。目前对ANKL的诊断国内外尚无统一标准，骨髓中NK细胞的异常大颗粒淋巴细胞比例没有明确的规定，但其较公认的诊断标准常基于三个因素：实验室特征(细胞形态学及免疫表型)，侵犯部位和临床特征[11,26]。

若外周血人工分类或骨髓细胞形态学检查中异常肿瘤NK细胞含量极低且异型性明显，流式细胞学检查难以确诊时，有研究学者Gao 等[26]对浸润实体器官的ANKL患者提出应当及时对受累实体组织器官如淋巴结、肝、脾进行病理活检，这对明确诊断也有重要意义。随着ANKL的进展，骨髓中的肿瘤细胞数量逐渐增加。在一项研究中，随着疾病的进展进行评估时，异常NK细胞的检测率从86.8%增加到97.4%[29]。因此，最好从血液、骨髓或其他组织部位获取多个标本，在未检测到阳性且临床怀疑患者患有ANKL等肿瘤时进行连续的流式细胞学分析。

所以为了明确ANKL的诊断，强调要对临床表现、细胞形态学、流式细胞术、细胞免疫表型、骨髓病理活检、细胞遗传学及分子生物学等多项检查进行综合分析。

3 ANKL的鉴别诊断

ANKL需要和结外NK/T细胞淋巴瘤、慢性NK细胞淋巴增殖性肿瘤(CLPD-NK)、大颗粒T淋巴细胞白血病(T-LGLL)进行鉴别。

3.1 结外NK/T细胞淋巴瘤 根据原发部位的来源不同，分为鼻区和非鼻区两种亚型，由于二者的细胞形态和免疫表型相同，在2008年WHO分类标准中被命名为同一种疾病，即结外(鼻型)NK/T细胞淋巴瘤(ENKL)。形态学和免疫表型与ANKL有重叠。二者均与EBV相关，在东亚人群中发病率增加，并且显示缺乏T细胞受体基因重排。然而，临床表现存在一定差异：(1)ANKL(约40岁)的年龄中位数小于ENKL(约50岁)。(2)鼻型(NKTCL)通常首发症状是局部的，如鼻衄、鼻腔溃烂及肿物等，病变相对局限，但在进展期会播散至其他器官；非鼻型NKCL 其原发病变部位通常是皮肤、消化道、 肺、脑、肾上腺、乳腺、睾丸及软组织，较少浸润骨髓。(3)无论治疗如何，ANKL预后都非常差，而ENKL的局部病变可能对化疗或放疗有关联[30]。罕见的ENKL患者可能发展为侵袭性，播散性疾病，并且可能与ANKL无法区分[30]。目前关于ANKL和ENKL是否实际代表同一疾病的不同阶段，也存在争议。然而专家共识将ANKL作为一种独特的疾病实体。基因组杂交比较也发现ANKL和ENKL之间有显著性差异：前者发现7p，17p和1q增加，且频率显著，而ENKL缺乏这些发现，并且常常表现出6q丢失[31]。

3.2 慢性NK细胞淋巴增殖性肿瘤(CLPD-NK) 大多数患者没有症状，无发热，无肝、脾及淋巴结肿大，不明原因的外周血成熟NK细胞增多(>2×109/L)，持续>6个月。发病的中位年龄为60岁，且人种之间没有差异，呈惰性的临床过程。通常EBV检测为阴性。在外周血和骨髓中，常有异常NK细胞浸润，与T-LGL细胞形态学特点相同，但通常CLPD-NK的免疫表型：(1)CD56弱阳性或者阴性，胞质CD3阳性，表面CD3阴性，颗粒酶B及M阳性；(2)可以出现抗原表达的减弱或者缺失(CD2、CD7、CD57、CD161)及CD5、CD8的异常表达；(3)NK细胞的ki-67表达水平低[6]；(4)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)不对称表达。CLPD-NK预后多良好，极少数有恶化，如若之前有慢性活动性EBV感染史、蚊虫叮咬过敏史或局部种痘水疱史等等EBV感染的NK细胞的患者病情易于加重及转化，这些患者应该密切随访观察。

4 ANKL的治疗

ANKL的预后非常不利，中位生存期为两个月。ANKL的最佳初始化疗方案尚未确定。目前对ANKL进行的前瞻性临床试验极少，现在对治疗的认识大都是基于化疗方法和临床结果的小型临床研究。由于NK细胞肿瘤细胞高表达多药耐药基因MDR1编码的多药转运糖蛋白(糖蛋白P)，对于采用传统化疗方案左旋门冬酰胺酶联合(CHOP)反应疗效不佳，而选择不受糖蛋白P影响的甲氨蝶呤及左旋门冬酰胺酶(L-ASP)，并具有抗NK细胞肿瘤活性的作用已被证实，Yamaguchi等[32]应用左旋门冬酰胺酶、甲氨蝶呤、地塞米松、异环磷酰胺及依托泊苷组成了SMILE方案治疗异常NK肿瘤细胞，目前临床试验Ⅰ、Ⅱ期疗效较好。然而基于SMILE方案会引起血常规全血细胞减少，造成严重的骨髓抑制等不良反应，所以该方案不推荐用于初治的ANKL患者[33]。而初治ANKL患者建议糖皮质激素联合左旋门冬酰胺酶治疗，待病情好转后再给予SMILE方案减量治疗。然而，其总体预后仍然很差。在化疗(包括左旋门冬酰胺酶)后达到完全缓解(CR)的患者很少在没有进一步治疗的情况下存活超过一年[7]。

为了改善患者预后，Ishida等[11]研究发现造血干细胞移植比化疗能有效的延长ANKL患者总生存期但由于病例数极少，随访时间短，此治疗方案是否为ANKL最佳的治疗方法尚待大样本病例研究证实。最近，国际血液与骨髓移植研究中心对进行异基因造血干细胞移植的21例ANKL患者进行了疗效评价，大多数患者在进行移植前接受了含L-天冬酰胺酶的化疗，结果显示其2年无进展生存期和总体生存期分别为20%和24%[34]，该研究表明，异基因造血干细胞移植可以持久地控制部分在移植前达到CR的ANKL患者。有研究指出脐带血是一种很好的替代干细胞来源[35]。但是从长期随访来看，76%的患者发生死亡，其主要死因为ANKL。曾有一项包含13例以结外NK/T细胞淋巴瘤和侵袭性NK细胞白血病为特征的全国性前瞻性临床研究，证明接受移植的患者预后较好[36]。因此，在特定的ANKL患者进行异基因造血干细胞移植可能有助于延长某些患者的生存期，但是成功率的报道相当有限。

治疗方案选择L-天冬酰胺酶(L-ASP)方案为基础的SMILE方案，后期有条件再配合造血干细胞移植，是ANKL推荐治疗方案。化疗中加入L-天冬酰胺酶的化学疗法已显示出改善效果[11]。L-天冬酰胺酶处理有助于提高存活率，对于各种含L-天冬酰胺酶的方案，如SMILE(地塞米松，甲氨蝶呤，异环磷酰胺，依托泊苷和L-天冬酰胺酶)，AspaMetDex(L-天冬酰胺酶，甲氨蝶呤和地塞米松)或VIDL(依托泊苷，异环磷酰胺，地塞米松和L-天冬酰胺酶)，目前还没有研究比较这些治疗方案的效果。

对正常NK细胞以及来自NK细胞肿瘤的细胞进行RNA测序和药物敏感性分析，可以更好地评估NK细胞对靶向治疗的易感性。 bcl2抑制剂在临床环境中有潜在的治疗适用性，Dufva等[21]报告了其他有效药物如热休克蛋白90(HSP90)抑制剂、Polo样激酶(PLK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，同时也表明NK细胞对JAK和HSP90抑制的敏感性主要是由于抑制了IL-2诱导的JAK/STAT激活。对患者来源的异种移植物进行体外药物筛选的特异性靶向治疗很有希望为ANKL患者的治疗提供另一种思路。另外有研究提出ANKL的几个预后因素：如患者年龄，血清乳糖脱氢酶水平和血清总胆红素水平[39]来评估患者预后状况，但都没有得到验证。

综上所述，ANKL 是一种罕见的致命性恶性肿瘤，临床症状复杂且缺乏特异性细胞遗传学和克隆性标记。尽管ANKL患者的预后不佳，随着时间的推移，我们对ANKL的认识进展缓慢，但骨髓细胞形态学的早期发现，结合实验室其他检查及临床资料综合分析，以及分子生物学方面取得的实质性进展，有助于本病早期诊断,积极控制并发症，防止疾病进一步恶化，制定有效的治疗方案可以提高患者的生存期，应引起广大医师和实验室工作人员的重视。随着医疗技术的快速发展，对NK细胞白血病量身定做的治疗相关的药理学实验以及对ANKL发病机制致癌通路如JAK/STAT的深入探究，为今后研究开发并寻找新的有效防治药物提供了新思路。