刘静 倪素娜 邢晓琳 焦思宁 石稳 安彦敏 康峰 薄力聪

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)发生与众多因素有关，其中免疫凝血异常是重要原因之一；表现为抗磷脂抗体、抗核抗体及相关抗体阳性、易栓组合指标异常、维生素D缺乏、高同型半胱氨酸等[1-6]。RSA患者即便保胎治疗成功，后期仍容易出现各种病理妊娠如：流产、早产、胎膜早破、羊水过少、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、胎死宫内、妊娠期糖尿病、妊娠期胆汁淤积等等，严重影响着母胎安全及妊娠结局[7-9]。如何能做到早期预测、及时干预、减少母婴损害，一直是妇产科医生亟待解决的问题。RSA发病机制复杂且具有多重性，目前多数学者认为广泛的血管内皮细胞损伤可能是多种疾病发病的中心环节，但治疗上尚无控制其发生、发展的最佳方法，故早期预测及预防显得尤为重要[10，11]。胎盘生长因子(plasma placental growth factor，PLGF)属血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成员，是评估胎盘生长发育的可靠指标[12]。可溶性Fms样酪氨酸激酶(soluble Fms-like tyrosine kinase，sFlt-1)属VEGF受体，与其结合可抑制其促血管生长作用，在先兆子痫及肿瘤发病中起一定作用，但在 RSA发病过程中的研究相对较少[13]。本研究为观察母血中sFlt-1、PIGF水平在 RSA患者体内的变化，选取我院后收诊的 RSA 患者血清中PIGF 及sFlt-1浓度及绒毛组织中PIGF及sFlt-1表达情况，旨在分析其在 RSA 诊断中的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1～12月我院收诊的RSA患者80例设为观察组，年龄20～34岁，平均年龄(31.5±3.1)岁；孕周6～12周，平均孕周(11.0±1.5)周。将同期于我院计生门诊自愿要求行人工流产结束妊娠的健康早孕女性80例设为对照组，年龄19～34岁，平均年龄(29.9± 3.4)；孕周6～12周，平均孕周(10.9±1.8)周。将观察组患者依据流产次数进行分层分析，其中2次自然流产40例，3次自然流产25例，4次自然流产15例，入选者无自然流产及复发性流产史，超声检查及尿人绒毛膜促性腺激素(hCG)检测，确诊为正常怀孕。2组年龄、孕周分布具有可比性(P>0.05)。入组前均向入选者讲明研究方法及目的，征求其同意，并签署知情同意书。见表1。

表1 2组临床资料比较

1.2 入选及排除标准

1.2.1 诊断标准：入选RSA 患者均有2次及以上的不明原因流产，此次怀孕期间再次出现典型的流产体征，并经超声检查、尿人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)检测，确诊为难免性流产。

1.2.2 入选标准：有RSA病史的患者(此次受孕保胎与否都可以纳入)，入组1年内的化验指标(任何一项)曾提示免疫或凝血指标异常：抗心磷脂抗体阳性(包括标准及非标准抗体)、抗核抗体谱阳性、封闭抗体、易栓组合指标异常、维生素D缺乏、高同型半胱氨酸血症、代酸代谢基因异常等，血小板聚集率、D-二聚体、血栓弹力图、生殖免疫抗体等。

1.2.3 排除标准：夫妇双方经外周血检查排除遗传因素、B超和宫腔镜检查排除生殖器解剖异常、性激素及血糖、胰岛素、甲状线功能检查排除内分泌原因异常、患者阴道分泌物及血液Torch检查排除感染因素。

1.3 试剂与方法 PIGF 及sFlt-1 试剂盒(上海科顺生物科技有限公司)；ELISA 试剂盒 (美国安迪生物公司)；PLGF兔抗人多克隆抗体 (北京博奥森生物技术有限公司)；兔抗人sFlt-1单克隆抗体(Usbiological公司)；DAB 显色剂(北京中杉金桥公司)；SP-9000 免疫组织化学试剂盒 (北京中杉金桥公司) 。术前采集2组入选者肘静脉血2 ml，静置15 min，1 760 g 离心力离心 15 min，取血清，-70℃保存待测；使用酶联免疫吸附试验(ELISA 法)检测血清中PIGF 及sFlt-1浓度；2组人流术后留取绒毛组织，冲洗后置于 4% 甲醛液中固定，常规包埋、切片，使用免疫组化 SP法检绒毛组织中PIGF及sFlt-1表达情况。每张切片取5个高倍镜视野，按半定量积分法行免疫组织化学评分，结果判定标准[14]： 强阳性(+++)：评价≥9分；中度阳性(++)：评分6～8分；弱阳性(+)：评分3～5分；阴性(-)：评分为0～2分。总分<5分为阴性，5～12分为阳性。

2 结果

2.1 2组血清sFlt-1、PIGF浓度比较 观察组血清sFlt-1浓度高于对照组，血清PIGF浓度则低于对照组，2组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清sFlt-1、PIGF浓度比较

2.2 2组绒毛组织中PIGF及sFlt-1表达情况比较 观察组绒毛组织sFlt-1阳性表达率高于对照组，PIGF表达阳性率则低于对照组，2组差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组绒毛组织中PIGF及sFlt-1表达情况 n=80,例(%)

2.3 观察组中各亚组间血清sFlt-1、PIGF浓度比较 2次组患者血清sFlt-1浓度高于3次组及4次组，血清PIGF浓度则低于3次组及4次组(P<0.05)；3次组患者血清sFlt-1浓度高于4次组，血清PIGF浓度则低于4次组(P<0.05)；3组间血清sFlt-1、PIGF浓度比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 观察组中各亚组间血清sFlt-1、PIGF浓度比较

3 讨论

临床上复发性流产患者数目众多，反复多次自然流产无论对患者本人还是对整个家庭都打击巨大，是当前重要的公共卫生问题，也是临床急需解决的重要问题[15]。复发性流产病因复杂，除遗传因素、感染因素、解剖因素、内分泌因素等病因以外，目前凝血状而已免疫因素开始备受关注[16-19]。当一系列针对性的筛查试验确定妊娠女性处于免疫异常或血栓前状态时，如何进行治疗是亟待解决的问题。低分子肝素、阿司匹林，泼尼松、羟氯喹、环孢素、免疫球蛋白及脂肪乳及免疫球蛋白等凝血免疫药物已经开始逐渐被应用于临床，并取得了较好的疗效[20]。但如何有效对 RSA 确诊，则对患者妊娠结局意义重大。

sFlt-1可以与血管内皮生长因子超家族(PIGF和VEGFA)结合，影响其正常功能发挥。血管内皮生长因子对母胎健康极为重要，它可以诱导血管生成，保护血管的内皮及功能[21]。sFlt可以使血管内皮细胞对肿瘤坏死因子a的敏感性增加，更容易诱发“炎性反应”，这种反应与子痫前期的某些变化相同[22]。sFlt及PIGF因检测方法简便、无创、可重复性强的优点，得到不少研究者关注，而PLGF以及sFlt/PIGF的比值对于子痫前期亦具有一定的预测价值，但对于复发性流产患者尤其免疫凝血异常RSA患者出现胎死宫内内、宫内生长受限、胎盘早剥、羊水过少、妊娠期高血压疾病，妊娠期糖尿病、妊娠期胆汁淤积症等病理妊娠的研究较少[22]。本研究结果显示，观察组血清sflt-1 水平较高，且胎盘绒毛组织中sflt-1表达阳性率亦增高；提示RSA 胚胎可能处于极低氧环境，此现象可导致 RSA 患者血清中sflt-1水平及胎盘绒毛组织中sflt-1比较性表达率增高；而sflt-1的异常增高，反向抑制VEGF 的血管催生能力，导致绒毛血管生成障碍，最终导致母胎交界面血管生成不良，而诱发孕早期流产发生[23]。PIGF属于VEGF家族成员，主要生物学功能是血管内皮细胞增殖、迁移、激活、促使胎盘血管的生成，抗血管内皮细胞凋亡，促进滋养细胞的增殖，增加血管通透性、维持妊娠过程中胎盘正常的血供和功能[24]。且其随着孕周的增加而升高，在孕26～30周浓度达到高峰，此后下降至分娩；故其是评估胎盘生长发育的参考指标。PIGF值偏低，反映了胎盘形成缺陷，另因其半衰期仅15 min，因而可以很好地反映胎盘即时功能[25]。有实验表明，PIGF具有促进血管新生及诱导血管内皮细胞激活、增殖、迁移的作用，可促进胎盘滋养层细胞的增殖和侵袭[26]。另有研究表明，sFlt-1高表达可抑制 PIGF 表达，使血管生成障碍、内皮加速损伤[27]。本研究结果显示，RSA 患者观察组血清sflt-1 水平及胎盘绒毛组织中sflt-1表达阳性率均增高，而血清sflt-1 水平及胎盘绒毛组织中PIGF表达阳性率则降低，其原因可能与sFlt-1 在RSA 孕妇体内竞争性与 PIGF 结合，导致血清sflt-1 水平及胎盘绒毛组织中PIGF表达阳性率下降，进而导致 RSA发病[23]。将观察组患者依据流产次数进行分层分析，其中2次自然流产40例，3次自然流产25例，4次自然流产15例，2次自然流产组患者血清sFlt-1浓度高于3次组及4次组，血清PIGF浓度则低于3次组及4次组(P<0.05)；3次组患者血清sFlt-1浓度高于4次组，血清PIGF浓度则低于4次组(P<0.05)；3组间血清sFlt-1、PIGF浓度对比均具有统计学意义(P<0.05)；亦证实血清sFlt-1及PIGF水平与复发性流产次数呈正相关。

综上所述，复发性流产患者血清sFlt-1明显增高， PIGF 浓度则明显下降，且血清sFlt-1及PIGF检测方法简便、无创、可重复性强，可作为诊断复发性流产的可靠方法。