钱冰涛 汤殿维 刘海涛 毕淑英 刘芳 王萌 宋庆

EB病毒(EBV)在人群中感染非常普遍，90%以上的成人血清EBV抗体阳性。EBV主要通过唾液传播，也可经输血途径传播[1]。了解EBV感染患者的免疫功能状态和感染后细胞形态，通常都是诊断EBV感染相关恶性肿瘤所必需的[2]。EBV感染40%～70%的症状发作患者中可检出EBV核酸，并且疾病发作后约2周时，检测阳性率可增至90%[3]。虽然慢性活动性EB病毒感染很少见，但其对多脏器造成不可逆损伤，对于临床症状反复并持续病程3月的患者，一定要尽早识别慢性活动性EB病毒感染[4]。EBV持续感染一般通过外周血中检测到高水平的EBV-DNA来确诊[5]。本文通过对感染EBV的传染性单核细胞增多症(IM)患儿的全血EBV-DNA水平进行检测，比较EBV-DNA阳性组与EBV-DNA阴性组患儿感染EBV后其细胞免疫功能尤其是淋巴细胞亚群的变化特点及其临床意义，为EBV-IM患儿的个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2019年12月北京航天中心医院儿科住院并确诊为EBV感染的传染性单核细胞增多症(IM)临床资料94例进行回顾性分析。男53例，女41例；男女比例为1.29∶1.00；发病年龄1～14岁，中位发病年龄5.1岁，5岁以下发病56例(59.6%)其中5岁以上发病38例(40.4%)。本研究通过航天中心医院医学伦理委员会批准，临床病例资料均有监护人签署知情同意书。

1.2 EBV感染的IM诊断标准 满足临床指标中的任意3项及实验室指标中的1项。临床指标:(1)发热;(2)咽扁桃体炎;(3)颈淋巴结大;(4)脾大;(5)肝大;(6)眼睑水肿。实验室指标:(1)抗 EBV-VCA-IgM和抗 EBV-VCA-IgG抗体阳性，且抗 EBV-NA-IgG抗体阴性;(2)抗 EBV-VCA-IgM抗体阴性，但抗 EBV-VCA-IgG抗体阳性，且为低亲和力抗体[6]。

1.3 分组及评估 根据IM患儿入院时EBV-DNA的拷贝数103将全血EBV-DNA分为(拷贝数>103)阳性组36例和(拷贝数<103)阴性组58例，对比淋巴细胞亚群评估免疫功能。入院后予阿昔洛韦抗病毒及对症支持治疗。其中25例EBV感染传染性单核细胞增多症患儿入院时淋巴细胞亚群和治疗1周后复查淋巴细胞亚群进行对比，评估患儿细胞免疫功能恢复情况。

1.4 方法 采用实时荧光定量PCR分别检测EBV感染的传染性单核细胞增多症确诊入院时、治疗1周全血EBV-DNA拷贝数。采用BriCyte E6流式细胞仪(T淋巴细胞抗体试剂包括CD3-FITC抗体、CD8-PE抗体、CD45-perCP抗体、CD4-APC抗体；B淋巴细胞抗体试剂包括CD3-FITC抗体、CD16+CD56-PE抗体、CD45-PerCP抗体、CD19-APC抗体。)进行全血标本流式细胞仪自动设门检测CD3+T细胞、CD4+T细胞(CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD19+)和NK细胞(CD3-CD16+56+)占淋巴细胞总数的百分比及其绝对值，绝对值测量方法为体积法。CD3+/CD4+比值为计算值。

随访：所有IM患儿均通过来院门诊复查或电话随访。

1.5 统计学分析 使用配对t检验比较治疗前后淋巴亚群的变化是否有差异，采用基于python的SciPy库(版本1.4.1,https://www.scipy.org/)实现；Pearson相关系数分析用于比较各项指标之间的相关性，采用“Pandas”进行相关性分析，一个基于Python的包(版本1.0.5；https://pandas.pydata.org/)，使用基于Python的“seaborn”库(版本0.10.1；https://seaborn.pydata.org/)，以及“matplotlib”库(版本3.2.2；https://matplotlib.org/)进行相关性热图绘制。采用配对t检验去比较EBV-DNA阳性组和阴性组、治疗前和治疗后淋巴亚群的变化是否有统计学差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床症状及体征 EBV感染IM患儿的临床表现多样，表现为多系统、多器官受累的临床综合征，其中以持续发热、咽峡炎、淋巴结大、肝脾大为主要临床表现。发热、颈部淋巴结肿大、咽扁桃体炎典型三联征症状，共74例，占78.2%。病初外周血异型淋巴细胞>10%共64例(68.0%)，异型淋巴细胞<10%共30例(32.0%)。见表1。

表1 EBV感染IM患儿临床表现及体征

2.2 全血EBV-DNA阳性组和阴性组对比淋巴细胞亚群，评估免疫功能 EBV-DNA阳性组CD3、CD8、CD4绝对值显著高于阴性组，差异均有统计学意义(P<0.05)；但2组NK绝对值细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

表2 EBV-DNA阳性组和阴性组淋巴亚群变化比较

组别CD8细胞NK细胞CD3细胞CD4阳性组(n=36)8 800.1±5 098.91 038.3±842.511 528.5±6 460.81 869.6±1 104.9阴性组(n=58)6 491.8±3 848.6801.8±622.58 640.3±4 147.21 453.4±563.8P值<0.05>0.05<0.05<0.05

2.3 25例EBV-IM患儿入院时淋巴细胞亚群水平和治疗1周后复查淋巴细胞亚群水平比较 CD8、NK细胞绝对值治疗1周后绝对值显著低于入院时，但仍高于正常范围，差异有统计学意义(P<0.05)；但2组CD3、B细胞绝对值细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 EBV-IM淋巴细胞亚群治疗前后比较

表3 EBV-IM淋巴细胞亚群治疗前后比较

时间CD8细胞NK细胞CD3细胞B细胞治疗前5 826.4±3 655.7954.4±662.17 859.1±4 255.7440.4±328.0治疗后2 869.6±1 646.9656.1±433.24 803.6±2 279.5386.4±278.8P值<0.05>0.05<0.05<0.05

3 讨论

本次回顾性研究共94例EBV原发感染导致传染性单核细胞增多症患儿，其中发热、颈部淋巴结肿大、咽扁桃体炎典型三联征症状，共74例，占比78.2%。Rea等[3]的回顾性研究纳入500多例患者，发现所有患者都出现淋巴结肿大，98%出现发热，85%出现咽炎。疲劳症状可能持续存在且严重。在另一项纳入150例患者的前瞻性研究中，大多数初始发热、咽痛等症状在1个月内缓解，而疲劳缓解得较慢， 13%的患者6个月后仍持续存在疲劳[7]。可能存在疲劳症状患儿主诉不清楚或临床医生未重视等原因，本次研究疲劳症状临床资料并不清晰。EB病毒感染可以引起呼吸系统受累，统计分析本研究中患儿存在咽扁桃体炎79例(84.0%)，诊断肺炎14例(14.9%)，部分患儿出现打鼾等气道受阻表现，气道堵塞严重者可酌情应用糖皮质激素，防止出现窒息危象。

肝损伤是传染性单核细胞增多症常见的早期并发症，考虑为EBV感染淋巴细胞浸润引起的自限性的并发症。本次研究显示肝大13例(13.8%)，肝功能转氨酶升高62例(5.3%)，肝功能转氨酶升高提示肝损伤，患儿口服葡醛内酯片、复方甘草酸苷片保肝治疗，规律门诊随访，复查肝功能转氨酶均降至正常。本次统计显示脾大41例(43.6%)，查体脾脏肋下均可触及，门诊随访复查腹部超声，嘱家长避免磕碰，免体育运动，均未发生脾破裂。Gayer等[4,5]对该病研究显示脾破裂相对很少见，大多数病例在诊断为传染性单核细胞增多症后3周内出现，发生脾破裂的患者中，其通常在出现症状后约14 d发生，但时间范围可从4 d到长达8周，半数可能自发发生。目前为止笔者还没有发现关于安全恢复体力活动的共识。在某些少数病例中，脾破裂可能为主诉症状[8,9]。因此传染性单核细胞增多症应关注脾破裂的风险。IM患儿偶尔可见泛发性斑丘疹、荨麻疹或瘀点状皮疹，而结节性红斑罕见[10]。

本研究显示患儿病初外周血异型淋巴细胞比例>10%共64例(68.0%)，异型淋巴细胞<10%共30例(32.0%)，异型淋巴细胞比例均数为13%。EBV感染IM外周血异型淋巴细胞多数为CD8细胞毒T淋巴细胞，主要是活化的(HLA-DR+) CD8+ T细胞，也包括CD16+自然杀伤 (natural killer,NK)[11]。异型淋巴细胞多于发病第3天出现，第1周逐渐增多，比例可≥10%，第2～3周达到最高峰，最高可达50%，一般持续5～7周。异型淋巴细胞10%以上的病例早期占比约90%，因此异型淋巴细胞对传染性单核细胞增多症的早期诊断具有一定价值。另一项对我国EBV感染传染性单核细胞增多症儿童的研究显外周血异型淋巴细胞>10%的病例占比只有41.8%[12]。一项研究中患者的大多数反应性淋巴细胞是CD8+细胞毒性T细，疾病的严重程度与CD8+淋巴细胞增多量及血液中EBV载量有关[13]。EBV特异性细胞毒性T-淋巴细胞被认为对控制急性及再发感染必不可少。T细胞活化导致1型辅助性T细胞产生细胞因子白介素-2和γ-干扰素[14]。

了解EBV感染患者的免疫功能状态和感染后细胞形态，通常都是诊断EBV感染相关恶性肿瘤所必需的[11]。EBV感染40%～70%的症状发作患者中可检出EBV核酸，并且疾病发作后约2周时，检测阳性率可增至90%[12]。虽然慢性活动性EB病毒感染很少见，但其对多脏器可能造成不可逆损伤，对于临床症状反复并持续病程3个月的患者，一定要尽早识别慢性活动性EB病毒感染[13]。EBV持续感染一般通过外周血中检测到高水平的EBV-DNA来确诊[14]。所以对于EB病毒感染后临床症状反复，EBV核酸拷贝数持续阳性或复查淋巴细胞亚群仍持续异常的，临床需警惕慢性活动性EB病毒感染、EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增多症等疾病。

CD4 T细胞能够促进B细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)和其他免疫细胞的增殖及分化，调节体液免疫和细胞免疫。CD8 T细胞由CTL和抑制性T细胞组成。本次回顾性研究数据显示EBV感染引起传染性单核细胞增多症患儿EBV-DNA阳性组CD4、CD8绝对值显著高于EBV-DNA阴性组(P<0.05)，因此EBV感染后EBV特异性CD4+和CD8+T细胞反应与EBV活跃复制有关联，提示特异性CD4+和CD8+T细胞反应对病毒的清除有着重要意义。张翊等[15]回顾性分析IM患儿的临床资料，IM患儿的CD3+、CD8+细胞比例明显高于正常对照组(P<0．01)，血EBV-DNA阳性与T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞的变化密切相关， EB病毒血症对病情严重程度和预后判断有一定的临床价值。

而其他相关报道的慢性活动性EB病毒感染患儿EBV特异的CTL数目和反应均降低或检测不到。邢燕回顾性研究慢性活动性EBV感染组患儿外周血CD4和CD8 T细胞计数均明显低于IM组，考虑原因为EBV感染后宿主的正常免疫应答反应很弱或检测不到，使EBV特异的CTL的数目和功能下调，感染的EBV不易被清除，从而引起慢性活动性EB病毒感染[16,17]。因此，对传染性单核细胞增多症患儿常规检查淋巴细胞亚群，有注意评估患儿EBV感染后免疫功能状态。陶小娟回顾性分析EBV感染患儿临床资料，IM组CD8+T细胞较慢性活动性EB病毒感染CAEBV组、EBV-HLH嗜血细胞综合征组显著升高(P均<0.05);EBV-HLH组的总T细胞、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK及B细胞比其余3组均显著下降(P均<0.05)。血清中的EBV-DNA水平与疾病种类及严重程度呈正相关，EBV感染导致的IM、CAEBV 及EBV-HLH 3种疾病发病机制均与免疫功能紊乱有关; 因此EB病毒感染患儿应注意监测EBV载量和细胞免疫功能，其动态变化可反映EBV感染后免疫状态和疾病进展的风险[18]。

本次回顾性研究数据中有25例监测淋巴细胞亚群功能，结果CD8细胞绝对值治疗1周后显著低于入院时(P<0.05)，但CD8+绝对值仍稍高于正常值，考虑细胞免疫功能紊乱有所恢复，1个月后门诊复诊IM患儿复查淋巴细胞亚群多恢复正常范围，临床症状也均恢复正常，提示患儿预后良好。其他研究显示IM急性期和IM恢复期患儿TLR2 mRNA,TLR9 mRNA,CD3+和CD8+水平均显著高于对照组(P<0.01)，且IM急性期均显著高于IM恢复期(P<0.01)。IM急性期Toll样受体TLR2mRNA、TLR9mRNA表达相对上调,而IM恢复期二者表达相对下调。IM急性期存在明显的免疫失衡,即CD3+ CD8+明显增高,提示在IM病程不同时期TLR2与TLR9的改变可能通过对T细胞的调节参与[19]。

NK细胞是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性免疫的核心调节细胞。NK细胞缺陷的患者易发生多种危及生命的病毒感染。本次回顾性研究25例EBV-IM患者的监测淋巴细胞亚群功能， NK细胞绝对值治疗1周后显著低于入院时(P<0.05)，但仍稍高于正常范围。大多数EB病毒感染相关的淋巴增生性疾病起源于EB病毒感染的B细胞，但也可感染CD4+、CD8+ 外周血T细胞和NK细胞[20]。邢燕等[16]回顾性研究慢性活动性EBV感染组患儿外周血NK细胞计数均明显低于IM组，提示NK细胞减少可能与EBV感染后慢性化相关，考虑与NK细胞缺乏导致CTL功能功能缺失有关。得出结论EBV感染宿主NK细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的减少现象可能与慢性活动性EB病毒感染发病有关[16]。HV-LPD是Epstein-Barr病毒阳性T/NK淋巴增生性疾病的一种皮肤形式。患者查血液中淋巴细胞亚群显示CD4+T细胞数量减少，CD4+/CD8+减少，NK细胞数量减少，B淋巴细胞减少，表明患者的细胞免疫和体液免疫紊乱[21,22]。

综上所述，EBV感染引起的传染性单核细胞增多症儿童外周血异型淋巴细胞增多，即CD8+T细胞明显增多，在免疫防御中有关键作用。IM患儿治疗1周后CD8、NK细胞绝对值较入院下降，1个月后淋巴细胞亚群逐渐恢复正常范围。检测EBV感染患儿外周血液淋巴细胞亚群有助于EB病毒感染免疫功能评估，帮助EB病毒感染相关疾病的诊断和鉴别诊断。出院随诊监测EBV载量和细胞免疫功能可反映EBV感染后免疫状态和疾病进展的风险。