李亭玉 刘 行 李一权 李文杰 李善智 王 政 于 桐 于成东 孟 媛 李太元 李 霄 金宁一（延边大学农学院，延吉 133000）

肺癌是全球发病率和病死率最高的癌症，并且其发病率和病死率呈迅速上升的趋势，分别占整个癌症的11.6%和18.4%［1］。肺癌细胞表面可表达多种蛋白，其中程序性死亡分子配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）是主要的免疫抑制蛋白之一，主要调节人体免疫功能，可以与免疫细胞表面的程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）相结合，减弱免疫细胞的活性和功能，从而抑制机体的免疫应答，协助肿瘤的发生、转移和免疫逃逸。当前人类肿瘤免疫疗法的热点之一就是抗PD-L1的免疫疗法，并且有望成为免疫治疗的重要手段［2］。

溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）既可以单独作为溶瘤剂，又可以作为抗癌基因的有效载体，是一种很有前途的抗肿瘤制剂，目前一些OVs 的种类已经被用于抗肿瘤制剂，如腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、细小病毒等数十种［3］。其中对腺病毒的研究最为广泛，目前常用的腺病毒载体是5 型腺病毒和2 型腺病毒［4］，但是不利的肿瘤微环境会影响溶瘤腺病毒发挥溶瘤效果，溶瘤腺病毒载体并不能完全消除肿瘤，如何改造腺病毒载体以提高溶瘤腺病毒的疗效及特异性和安全性是目前临床备受关注的问题。

端粒酶是一种核糖核蛋白酶，具有逆转录酶活性。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）作为端粒酶的限速成分，在端粒酶的活化中发挥决定性的作用［5］。多数正常人体细胞端粒酶活性被抑制，但在大部分人类恶性肿瘤中能观察到hTERT 高度表达和端粒酶激活，因此癌细胞获得了无限的增殖能力［6］。这为肿瘤的治疗创建了新方法。在过去的研究中本课题组已经利用hTERT 的特性构建了能够特异性杀伤肿瘤细胞的重组腺病毒（Ad-hTERTp-E1a，Ad-T）［7］。在其他研究中本课题组已经表明重组腺病毒对其他几种肿瘤细胞具有显著的杀伤作用［8-11］。本研究利用重组腺病毒Ad-T 下调肿瘤细胞PD-L1 的表达，并验证其对肺癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用，为今后肺癌治疗提供理论依据，并探索肺癌治疗的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 溶瘤腺病毒及人小细胞肺癌细胞株（NCI-H446）、人鳞状细胞肺癌细胞株（NCI-H226）、人肺癌细胞株（A549）由所在军事医学研究院军事兽医研究所分子病毒学与免疫学实验室保存。结晶紫染色液购自Beyotime 公司，WST-1 购自Roche公司，Hoechst、JC-1 购自Invitrogen 公司，PD-L1 及GAPDH兔单克隆抗体购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR 法检测重组腺病毒Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 细 胞PL-L1 表达的影响 将对数生长期的3 种细胞以2.5×105个/孔铺在6 孔板中，37℃、5%CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T各100 MOI 感染3 种细胞，培养24 h、48 h。到达培养时间后按照生工RNA 提取试剂盒进行提取、定量，常规方式反转录为cDNA。以cDNA 为模板用于PCR 扩增。PCR 反应条件：预热变性95℃5 min；变性94℃5 s；退火62℃30 s；延伸72℃30 s，共40个循环。每个样品设定3 个复孔，PD-L1 的Ct 值经内参基因GAPDH 标准化后，采用2-ΔΔCt公式比较各组间PD-L1 的表达情况，引物序列：PD-L1 正向5'-AGC⁃TATGGTGGTGCCGACTA-3'，反向5'-CAGATGACTTCGGCCTTGGG-3'，GAPDH 正向5'-GACCCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，反 向5'-GAATTTGCCATGGGTGGAAT-3'。

1.2.2 Western blot 法验证重组腺病毒Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 细 胞PL-L1 表达的影响 将对数生长期的3 种细胞以5×105个/孔铺在6 孔板中，37℃、5% CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T各100 MOI分别感染3种细胞，培养24 h和48 h。到达培养时间后采用蛋白质提取试剂盒提取蛋白，BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白浓度并定量，加入5×SDS 蛋白上样电泳缓冲液，100℃加热10 min 后冷却备用。每孔等量蛋白上样，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，并将蛋白转至PVDF 膜上，用TBST 配制的5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗PD-L1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4℃孵育过夜，充分洗膜后加入二抗，室温孵育30 min，ECL显影。

1.2.3 重组腺病毒Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞的抑制作用

1.2.3.1 结晶紫法 将对数生长期的3 种细胞以2.5×105个/孔铺在12孔板中，37℃、5%CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分别感染3 种细胞，培养24 h和48 h。取上述孔板，弃去每孔上清液，用无菌PBS 冲洗3 次，每孔加入500 μl 0.4%结晶紫染色液，室温静置染色10 min吸出染色液，PBS冲洗3次，晾干并拍照分析。

1.2.3.2 WST-1 法 将处于对数生长期的3 种细胞以5×103个/孔铺在96 孔板中，每孔培养体积为100 μl，37℃、5%CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI分别感染3种细胞，分别培养24 h和48 h后弃掉培养液，每孔加入100 μl WST-1稀释液（1∶9稀释的WST-1 染色液）在37℃、5%CO2培养箱中避光孵育90 min，对照孔处理方法同上，用酶标仪在450 nm振荡20 s，测每孔的OD值。按照如下公式计算其抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（对照孔OD 值-处理孔OD值）/对照孔OD值×100%。

1.2.4 重组腺病毒Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞凋亡水平的影响

1.2.4.1 Hoechst 法 将盖玻片放在6 孔板中，制备单层细胞，细胞密度为2.5×105个/孔，37℃、5%CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分别感染3 种细胞，分别培养24 h 和48 h 后弃培养基，每孔加入1 ml Hoechst稀释液（按1∶1 000稀释Hoechst染色液）置于37℃、5%CO2培养箱染色10 min，在避光的环境，弃工作液，PBS 清洗3 次，倒置盖玻片置于载玻片上，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.4.2 JC-1 法 将盖玻片放在6 孔板中，制备单层细胞，2.5×105个/孔，37℃、5%CO2培养24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分别感染3 种细胞，分别培养24 h 和48 h 后弃培养基，每孔加入1 ml JC-1 稀释液（1∶1 000 稀释的Hoechst 染色液）置于37℃、5%CO2培养箱染色10 min，在避光的环境，弃工作液，PBS 清洗3 次，倒置盖玻片置于载玻片上，荧光显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析 数据以表示，采用GraphPad Prism 5.0软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光定量PCR 检测Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞表达PD-L1的影响 荧光定量PCR结果如图1所示，与对照组组相比，Ad-T组的3种细胞中PD-L1 的表达量均显著下降，且随Ad-T 作用时间延长，PD-L1的表达量减少更加明显（P＜0.01）。

图1 RT-qPCR 法检测Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞PD-L1表达的影响Fig.1 Effect of Ad-T on expression of PD-L1 of NCI-H446，NCI-H226 and A549 was analyzed by RT-qPCR

2.2 Western blot 法验证Ad-T 对NCI-H446、NCIH226、A549 细胞表达PD-L1 的影响 Western blot结果如图2 显示，与对照组和Ad-Mock 组相比，Ad-T组的3 种细胞中PD-L1 的表达量均下降，且随Ad-T作用时间延长，PD-L1 的表达量减少。这与荧光定量PCR 结果相一致。结果表明Ad-T 能够抑制肿瘤细胞自身产生的免疫逃逸能力。

图2 Western blot 法检测Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞PD-L1表达的影响Fig.2 Effect of Ad-T on expression of PD-L1 of NCIH446，NCI-H226 and A549 was analyzed by Western blot

2.3 Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 细胞的抑制作用 Ad-Mock、Ad-T各100 MOI分别感染3种细胞，在24 h 和48 h 进行结晶紫染色和WST-1 检测，结果如图3所示，3种细胞在感染Ad-Mock、Ad-T后，结晶紫染色强度均呈下降趋势，且随时间延长其增殖抑制作用有显著的提升，抑制程度Ad-Mock＞Ad-T，48 h＞24 h，而Ad-Mock 与对照组无显著性差异；WST-1 结果显示，在24 h 时，Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 的抑制率分别为：52.27%、30.91%和20.54%；在48 h 时，Ad-T 对3 种细胞的抑制率分别为：85.58%、37.98%和39.36%，而Ad-Mock对细胞的抑制率随时间增加，无显著性差异。

图3 Ad-T对NCI-H446、NCI-H226、A549细胞的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Ad-T on proliferation of NCIH446，NCI-H226 and A549 cells

2.4 Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 细胞凋亡的影响 Hoechst结果如图4所示，3种细胞感染Ad-T后，部分细胞核呈亮蓝色浓染或碎裂，且随作用时间增长，细胞逐渐减少，而Ad-Mock与对照组的细胞核呈均一蓝色荧光。表明，Ad-T 对肺癌细胞产生了显著的凋亡诱导作用。JC-1 结果：与对照组和Ad-Mock 组相比，Ad-T 对细胞的抑制作用通过线体膜电位的变化而表现出来，随时间的增加，凋亡的细胞逐渐增多，JC-1 由最初的红色聚集体逐渐变为绿色单体。表明，Ad-T 诱导的肺癌细胞凋亡主要为线粒体途径的凋亡。

图4 Ad-T 对NCI-H446、NCI-H226、A549 细胞凋亡的影响（×400）Fig.4 Effects of Ad-T on apoptosis of NCI-H446，NCIH226 and A549 cells（×400）

3 讨论

肺癌的发病率和病死率在所有癌症中位列第一［12-13］，严重威胁人类健康，目前对肺癌治疗最常用的方式还是化疗和放疗，这两种方式虽然有效，但没有特异性，杀死癌细胞的同时也伴随着严重的毒副作用，使患者的生活质量不能得到保证，尽管当前肺癌在免疫治疗、分子靶向治疗等精准医疗领域取得了一定的成果，然而这些研究还处于临床二线或二线以上临床阶段，治疗尚未成熟［14］。本研究旨在通过新型生物治疗手段，为今后肺癌的治疗提供新的思路和方法。

近年来，随着生物医学及基因工程技术的发展，已经开发出很多新的肿瘤治疗方法，包括溶瘤病毒疗法等，它是一种治疗肿瘤的新方法，当前用于肿瘤基因治疗的溶瘤病毒有腺病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、呼吸肠道病毒等数十种［15-16］。其中对腺病毒的研究最为广泛，本课题组前期通过对腺病毒进行基因工程改造，利用hTERT 启动子构建了一个特异性重组腺病毒，命名为Ad-hTERTp-E1a（Ad-T），hTERT 启动子是一种可以激活肿瘤细胞中某些基因的复制、表达的特异性启动子，而在正常细胞被抑制，这使得腺病毒能够特异性识别肿瘤细胞并在肿瘤细胞内大量增殖，可有效提高溶瘤腺病毒的靶向作用和抗肿瘤效果［9］。

PD-L1 是在胎盘文库中发现的一种免疫抑制因子，又称CD274或B7-H1［17］。PD-L1属于B7家族，可广泛表达于多种细胞，包括肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞等，其他正常组织也可经过诱导表达PD-L1，主要作用是调节人体免疫功能，肿瘤细胞可通过表达PD-L1 与T 细胞表面的PD-1 结合，使免疫细胞失去攻击能力［18］。肿瘤细胞正是充分利用其特性，通过诱导PD-L1 表达上调从而直接或间接抑制T 细胞对癌细胞的杀伤功能，抑制炎症细胞的免疫效应，进而产生免疫逃逸。机体内PD-L1 水平直接反映其免疫功能。通过干扰调控PD-L1表达的基因或通路，可有效降低PD-L1的表达，恢复机体的免疫防御功能，因此抗PD-L1 研究有望成为肿瘤免疫治疗的重要手段。在本研究中，首先通过荧光定量PCR 及Western blot 法发现，Ad-T可下调3种肺癌细胞上PD-L1 的表达，且随作用时间的延长，PD-L1 下调更加明显；通过结晶紫染色、WST-1、Hoechst 和JC-1 法发现Ad-T 还可抑制肺癌细胞，并通过降低线粒体膜电位的方式来诱导细胞凋亡，结果表明，Ad-T可抑制肺癌细胞表达PD-L1，同时也可诱导肺癌细胞的凋亡，对肺癌细胞具有抑制作用。

综上所述，重组腺病毒Ad-T可抑制肺癌细胞表达PD-L1，同时也可诱导肺癌细胞的凋亡，对肺癌细胞具有抑制作用，由此推测特异性溶瘤腺病毒可抑制肿瘤免疫逃逸，增强机体的免疫防御功能，为今后肺癌治疗提供理论依据并探索肺癌治疗的新方法。